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Gewebespezifische und epigenetische Regulation der KIBRA-Expression in humanen Nieren- und Nervenzellen

Der KIBRA-Genlocus wurde bereits mehrfach mit Gedächtnisleistung und der late-onset Alzheimer-Erkrankung assoziiert. Zudem scheint KIBRA ein wichtiger Regulator des Hippo-Signalwegs zu sein, welcher an der Kontrolle der Organgröße, der Zellregeneration und an apoptotischen Prozessen beteiligt ist. In dieser Arbeit wurden die KIBRA-Genstruktur sowie die gewebespezifische und epigenetische Regulation der KIBRA-Expression in Nieren- und Nervenzellen untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass KIBRA über einen konstitutiven Core-Promotor (P1a) und drei nierenspezifische alternative Promotoren (P1b, P2 und P3) verfügt. Außerdem wurde der Transkriptionsfaktor transcription factor 7 like 2 (TCF7L2) im Komplex mit Yes-associated protein 1 (YAP1) und TEA domain family member (TEAD) als wichtiger Regulator des Promotorsystems identifiziert. Ferner konnte gezeigt werden, dass der Methylierungsstatus der beiden identifizierten CpG-Inseln bei der Regulation von KIBRA eine wichtige Rolle spielt.

Titel: Gewebespezifische und epigenetische Regulation der KIBRA-Expression in humanen Nieren- und Nervenzellen
Verfasser: Guske, Katrin GND
Gutachter: Brand, Eva
Organisation: FB 13: Biologie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2014
Publikation in MIAMI: 20.10.2014
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: KIBRA; Hippo-Signalweg; Wnt-Signalweg; alternatives Promotorsystem; TCF7L2; gewebespezifische und epigenetische Regulation
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-11379360758
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-11379360758
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Inhalt:
Abkürzungen I
Abbildungsverzeichnis IV
Tabellenverzeichnis VI
Abstract VII
1. Einleitung 1
1.1. Kontrolle der eukaryotischen Genexpression 1
1.1.1. Cis- regulatorische DNA/RNA-Elemente 1
1.1.1.1. Der Core-Promotor 1
1.1.1.2. Cis-regulatorische Elemente der 5′-untranslatierten
Region (5′-UTR) 2
1.1.1.3. Der Transkriptionszyklus 3
1.1.1.4. Proximaler Promotor 4
1.1.1.5. Enhancer, Scilencer und Isolatoren 5
1.1.2. Posttranslationale Genregulation 6
1.1.3. Alternative Promotoren 7
1.1.4. CpG-Insel-Promotoren 8
1.2. Epigenetische Mechanismen 8
1.2.1. Histonmodifikation 9
1.2.2. DNA-Methylierung 10
1.2.3. Regulation der Genexpression durch DNA-Methylierung 11
1.3. Gerüstproteine 12
1.3.1. Kidney and brain (KIBRA) - ein zytoplasmatisches Gerüstprotein 13
1.3.1.1. KIBRA-Proteindomänen 14
1.3.1.2. KIBRA und Gedächtnisleistung 15
1.3.1.3. KIBRA-Zellmigration und -polarität 16
1.3.1.4. KIBRA und der Hippo-Signalweg 16
1.3.2. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg 18
1.4. Ziel der Arbeit 20
2. Material 22
2.1. Chemikalien 22
2.2. Verbrauchsmaterialien und Kits 23
2.3. Seren und Medien 24
2.4. DNA-Marker 24
2.5. Enzyme 24
2.6. Antikörper 25
2.7. Plasmide und Vektoren 25
2.8. Escherichia coli (E. coli)-Stämme 25
2.9. Eukaryotische Zelllinien 25
2.10. Geräte 26
3. Methoden 28
3.1. Molekularbiologische Methoden 28
3.1.1. Isolierung von Nukleinsäuren 28
3.1.1.1. Isolierung genomischer DNA 28
3.1.1.2. Isolierung von RNA 28
3.1.1.3. Isolierung von Plasmid-DNA 28
3.1.2. Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration 29
3.1.3. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 29
3.1.3.1. Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) 31
3.1.3.2. RNA ligase mediated rapid amplification of
cDNA ends (RLM-RACE) 31
3.1.4. DNA/RNA-modifizierende Reaktionen 32
3.1.4.1. Restriktionsendonukleasen 32
3.1.4.2. DNA-Dephosphorylierung 33
3.1.4.3. Ligation 33
3.1.5. Agarose-Gelelektrophorese 33
3.1.6. Aufreinigung von DNA-Fragmenten 34
3.1.6.1. Gelextraktion 34
3.1.6.2. Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion 34
3.1.6.3. Exo/SAP-Aufreinigung 35
3.1.7. Sequenzierung 35
3.1.8. Reportergenassay 35
3.1.8.1. Konstruktion der Promotordeletionskonstrukte 35
3.1.8.2. Bestimmung der Transkriptionsaktivität 37
3.1.8.3. Überexpressionsexperimente 37
3.1.9. Zielgerichtete Mutagenese 38
3.1.10. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) 39
3.1.11. In vitro Methylierung 41
3.1.12. Bisulfitkonvertierung 41
3.2. Zellbiologische und mikrobiologische Methoden 42
3.2.1. Prokaryotische Zellen 42
3.2.1.1. Kulturbedingungen prokaryotischer Zellen 42
3.2.1.2. Herstellung kompetenter Zellen 43
3.2.1.3. Transformation 43
3.2.2. Eukaryotische Zellen 44
3.2.2.1. Kulturbedingungen eukaryotischer Zellen 44
3.2.2.2. Lagerung der Zellen 44
3.2.2.3. Transiente Transfektion 45
3.2.3. Studienpopulationen 45
3.2.4. In silico Analysen 46
3.2.5. Statistische Auswertung 46
4. Ergebnisse 47
4.1. Identifizierung von TSS 47
4.2. Identifizierung von regulatorischen Bereichen 50
4.2.1. Identifizierung des alternativen 5′-Promotors P1b 52
4.2.2. Identifizierung der Intron-Promotoren P2 und P3 54
4.2.3. Einfluss der 5′-UTR auf die Transkriptionsaktivität 56
4.3. Identifizierung genetischer Varianten im
KIBRA-Promotorbereich P1 57
4.3.1. Einfluss der identifizierten genetischen Varianten auf die
P1-Transkriptionsaktivität 59
4.3.2. Analyse der molekularen Haplotypen 60
4.4. Identifizierung von TCF7L2-Bindestellen in den
KIBRA-Promotor P1a und P2 61
4.4.1. Regulation der KIBRA-Transkription durch TCF7L2 62
4.4.2. Mutagenese der TCF7L2-Bindestellen in P1a 63
4.4.3. Nachweis der TCF7L2-Bindung an den KIBRA-Promotor P1a 64
4.4.4. Regulation der KIBRA-Expression durch die
Transkriptionsfaktoren TCF7L2, YAP1 und TEAD4 65
4.5. Identifizierung von CpG-Inseln im KIBRA-Promotor 68
4.6. Effekt von Promotormethylierung auf die
Transkriptionsaktivität von P1 69
4.7. KIBRA-Methylierungsmuster bei Nierenzellkarzinom 72
5. Diskussion 74
5.1. Die KIBRA-Expression basiert auf multiplen zelltypspezifischen
TSS und einem komplexem Promotorsystem 75
5.2. Einfluss genetischer Varianten auf die Promotoraktivität 77
5.3. Regulation der KIBRA-Expression über
Hippo- und Wnt-Signalweg 78
5.3.1. Regulation der KIBRA-Expression durch TCF7L2 79
5.3.2. TCF7L2, YAP1 und TEAD4: ein Modul bei der
KIBRA-Expressionsregulation 80
5.4. CpG-Inseln und Methylierung 81
5.4.1. Einfluss des Methylierungsgrads auf die KIBRA-Expression 82
5.4.2. KIBRA-Methylierungsgrad im Nierengewebe 82
5.5. Zusammenfassung 84
6. Ausblick 85
7. Referenzen 87
8. Anhang 112
9. Kongressbeiträge 114
10. Publikationen 116