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Bestimmung wichtiger Bindungseigenschaften des transsynaptischen Neurexin-Neuroligin-Komplexes mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz-Technologie

Das Zentralnervensystem bildet ein komplexes Netzwerk aus Neuronen, die an den Synapsen miteinander kommunizieren. An der Synapse findet eine Interaktion zwischen den Adhäsionsproteinen Neurexin (präsynaptisch) und Neuroligin (postsynaptisch) statt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Bindung der beiden Partner unter Verwendung der Oberflächenplasmonresonanz-Technologie, einer optischen Messmethode, die Daten über Affinität und Kinetik in Echtzeit liefert. Bei den Experimenten konzentrierte ich mich auf die Auswirkungen einer spezifischen Sequenz aus 37 Aminosäuren in β-Neurexin, einer extrazellulär kürzeren Variante dieser synaptischen Zelloberflächenmoleküle. Es zeigt sich, dass die 37 Aminosäuren eine inhibitorische Wirkung auf die Bildung des Neurexin/Neuroligin-Komplexes haben, während sie ihn nach erfolgter Bindung stabilisieren. Die Diskussion vergleicht die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse mit Referenzarbeiten und stellt methodische Unterschiede heraus.

Titel: Bestimmung wichtiger Bindungseigenschaften des transsynaptischen Neurexin-Neuroligin-Komplexes mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz-Technologie
Weitere Titel Bestimmung wichtiger Bindungseigenschaften des transsynaptischen Neurexin/Neuroligin-Komplexes mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz-Technologie
Verfasser: Oertel, Michael GND
Gutachter: Missler, Markus
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
FB 13: Biologie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2014
Publikation in MIAMI: 28.11.2014
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: Neurexin; Neuroligin; Synapse; synaptische Adhäsion; SPR; Protein-Protein-Interaktion
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit; Biowissenschaften; Biologie; Chemie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-21339566223
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-21339566223
Onlinezugriff:
Inhalt:
1 Einleitung ............................................................................................................................. 1
1.1 Die chemische Synapse ....................................................................................................... 1
1.2 Synaptische Adhäsion ......................................................................................................... 3
1.3 Nrxn als Organisatoren der Präsynapse .............................................................................. 4
1.4 Nlgn als Organisatoren der Postsynapse ............................................................................. 9
1.5 Nrxn und Nlgn als Kandidatengene für psychiatrische Krankheiten ................................ 12
1.6 Der transsynaptische Nrxn/Nlgn-Komplex ....................................................................... 14
1.7 SPR-Technologie als Methode zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen ............... 15
1.8 Zielsetzung der Arbeit ....................................................................................................... 20
2 Material und Methoden ....................................................................................................... 21
2.1 Abkürzungen ..................................................................................................................... 21
2.2 Geräte ........................................................................................................................... 23
2.3 Chemikalien ...................................................................................................................... 26
2.4 Bakterienstämme ............................................................................................................... 29
2.5 Zellkulturmedien und antibiotische Zusätze ..................................................................... 29
2.6 Zellkulturen ....................................................................................................................... 29
2.7 Vektoren ........................................................................................................................... 29
2.8 Zellbiologische Methoden ................................................................................................ 30
2.8.1 Transfektion von HEK293-Zellen ............................................................. 31
2.9 Proteinbiochemische Methoden ........................................................................................ 31
2.9.1 Äquilibrierung der Protein A beads............................................................ 32
2.9.2 Bindung der IgG Fusionsproteine an Protein A beads ............................... 32
2.9.3 Elution der IgG-Fusionsproteine von Protein A beads............................... 32
2.9.4 Aufkonzentration mit Amicon Ultra-4 Zentrifugen Filter ......................... 33
2.9.5 Aufkonzentration mit UPPA-Protein Konzentrations-Kit ......................... 33
2.9.6 Aufkonzentration mit Zeba Entsalzungs-Zentrifugen-Säule ..................... 34
Inhalt
2.9.7 Aufkonzentration mit PIERCE Konzentrator PES, 3k (88512) ................. 35
2.9.8 Pufferwechsel mit PUR-A-Lyzer (Fa. Sigma Aldrich) .............................. 35
2.9.9 Aufbereitung von NlgnΔB mit Proteaseschnittstelle ................................. 35
2.9.10 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) ................................. 36
2.9.11 Konzentrationsbestimmung von Proteinen ................................................ 37
2.10 Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Messungen ............................................................. 37
2.10.1 Physikalische Grundlagen der SPR ........................................................... 37
2.10.2 Ablauf der SPR-Messung .......................................................................... 39
2.10.3 Experimentelles Design der SPR-Messung ............................................... 40
2.10.4 Auswertung der Messdaten ........................................................................ 41
2.11 Molekularbiologische Methoden ...................................................................................... 41
2.11.1 Vorbereitung der kompetenten Zellen ........................................................ 41
2.11.2 Elektrotransformation ................................................................................ 42
2.11.3 Aufreinigung von Plasmid-DNA („Maxi-Prep“) ....................................... 42
2.11.4 Agarose-Gelelektrophorese ....................................................................... 43
3 Ergebnisse ........................................................................................................................... 44
3.1 Aufreinigung der Nrxn- und Nlgn-Konstrukte ................................................................. 44
3.2 Spezifität des Bindungsassays .......................................................................................... 47
3.3 Die LNS6 bindet spezifisch und hochaffin an NlgnΔB .................................................... 52
3.4 Die β-spezifische Sequenz behindert die Bindung an Nlgn .............................................. 55
3.5 SPR-Messung der α-Nrxn mit Spleißeinfügung 4 auf einem Nlgn-Chip ......................... 58
4 Diskussion ........................................................................................................................... 62
4.1 Vorteile und Limitationen der SPR-Technologie .............................................................. 62
4.2 Etablierung eines Messprotokolls ..................................................................................... 64
4.3 Die LNS6 in Interaktion mit NlgnΔB – neue Erkenntnisse über eine bekannte Bindung 70
4.4 Die β-spezifische Sequenz ................................................................................................ 71
4.5 α-Nrxn – Limitationen und Perspektiven des Bindungsassays ......................................... 78
5 Ausblick ........................................................................................................................... 80
Inhalt
Widmung ........................................................................................................................... 81
Danksagung ........................................................................................................................... 82
Literatur ........................................................................................................................... 84