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Intrazellulärer Transport des synaptischen Zelloberflächenmoleküls Neurexin

Neurone sind polarisierte Zellen, deren interzellulaere Kontakte der Signalweiterleitung dienen. Diese strukturelle Grundlage spiegelt sich in prae- und postsynaptischem Transport wider. Das Zelladhaesionsmolekuel Neurexin bildet mit Neuroligin einen heterologen transsynaptischen Komplex, welcher ein ideales Modell zur Untersuchung der spezifischen Transportmechanismen ist, und der Reifung synaptischer Kontakte und Signalweiterleitung dient. Durch live imaging-Verfahren wurde die Art und Dynamik Neurexin-positiver Transportvesikel, ihre Abhaengigkeit vom neuronalen Zytoskelett sowie von molekularen Motoren untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Neurexin mit Synaptophysin in synaptic vesicle protein transport vesicles zur Praesynapse befoerdert wird. Axonal ist der Transport schneller und kontinuierlicher als in Dendriten, Nrxn1beta-positive Vesikel sind schneller als Nrxn1alpha-positive Vesikel. Dies beruht auf der Orientierung der Mikrotubuli sowie vermutlich der Packungsdichte der Neurexinisoformen innerhalb der Vesikel. Durch Colokalisations- und shRNA-vermittelte knock down Experimente konnte nachgewiesen werden, dass das Kinesin KIF1A fuer den Transport notwendig ist. Mittels pH-abhaengiger Fluorophore war es moeglich, die Fusion Neurexin-positiver Vesikel mit der Plasmamembran nachzuweisen. Die vorliegende Arbeit stellt die erste umfangreiche Untersuchung ueber den intrazellulaeren Transportmechanismus von Neurexin an lebenden Neuronen dar.

Titel: Intrazellulärer Transport des synaptischen Zelloberflächenmoleküls Neurexin
Verfasser: Neupert, Christian GND
Gutachter: Missler, Markus
Organisation: FB 13: Biologie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2015
Publikation in MIAMI: 15.04.2015
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: Neurexin; Synapse; Transport; KIF1A; Autismus
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-39299434818
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-39299434818
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Inhalt:
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ................................................................................................................... 9
1.1 Chemische Synapsen ........................................................................................... 9
1.2 Der Neurexin/Neuroligin-Komplex ................................................................... 13
1.3 Autistische Erkrankungen .................................................................................. 18
1.4 Intrazellulärer Transport .................................................................................... 19
1.5 Zielsetzung der Arbeit ........................................................................................ 26
2. Material & Methoden ............................................................................................... 27
2.1 Material .............................................................................................................. 27
2.1.1 Geräte .......................................................................................................... 27
2.1.2 Chemikalien ................................................................................................ 28
2.1.3 Oligonukleotide ........................................................................................... 29
2.1.4 Vektoren ...................................................................................................... 30
2.1.5 Antikörper ................................................................................................... 31
2.1.6 Mauslinien ................................................................................................... 32
2.1.7 Zelllinien ..................................................................................................... 32
2.1.8 Bakterienstämme ......................................................................................... 32
2.1.9 Nährmedien und Zusätze ............................................................................ 33
2.1.10 Enzyme ..................................................................................................... 35
2.1.11 Kits ............................................................................................................ 36
2.1.12 Software .................................................................................................... 36
2.2 Methoden ........................................................................................................... 37
2.2.1 Molekularbiologische Methoden ................................................................ 37
2.2.1.1 Klonierungsstrategien .......................................................................... 37
2.2.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (Expand™ High Fidelity System) ........... 37
2.2.1.3 In vitro Mutagenese (QuikChange® Site-Directed Mutagenesis) ....... 38
2.2.1.4 Restriktionsenzym-Verdau von DNA .................................................. 39
2.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................. 40
2.2.1.6 Gelextraktion (QIAEX II Agarose Gel Extraction) ............................. 40
2.2.1.7 Phenol-Chloroform-Extraktion ............................................................ 41
2.2.1.8 Express Plasmid Minipräparation ........................................................ 41
2.2.1.9 Plasmid Minipräparation (NucleoSpin Plasmid) ................................. 42
2.2.1.10 Dephosphorylierung ........................................................................... 42
2.2.1.11 Ligation .............................................................................................. 43
2.2.1.12 Elektrotransformation ........................................................................ 43
2.2.1.13 Plasmid Maxipräparation (NucleoBond PC500) ............................... 43
2.2.1.14 Konzentrationsbestimmung von DNA ............................................... 44
2.2.1.15 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse ........................................ 45
2.2.2 Zellbiologische Methoden .......................................................................... 46
2.2.2.1 Präparation und Kultivierung primärer Astrozyten ............................. 46
2.2.2.2 Präparation und Kultivierung primärer hippokampaler Neurone ........ 47
2.2.2.3 Transfektion primärer hippokampaler Neurone ................................... 49
2.2.2.4 Kultivierung der Zelllinien HEK-TsA201, N2A und Cos-7 ................ 50
2.2.2.5 Transfektion von HEK-TsA201, N2A- und Cos-7-Zellen .................. 51
2.2.3 Zytochemische Methoden ........................................................................... 52
2.2.3.1 Fixierung und immunozytochemische Färbung ................................... 52
2.2.3.2 Oberflächenmarkierung ....................................................................... 52
2.2.3.3 Fluoreszenzmikroskopie ...................................................................... 52
2.2.3.4 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ............................................. 53
2.2.3.5 Statistische Auswertung ....................................................................... 54
3. Ergebnisse ................................................................................................................ 55
3.1 Charakterisierung Nrxn-positiver Transportvesikel .......................................... 55
3.2 Dynamik von Nrxn-positiven Transportvesikeln ............................................... 64
3.3 Nrxn-Transport ist abhängig von Mikrotubuli und synaptischer Aktivität ....... 69
3.4 KIF1A ist notwendig für den Transport von Nrxn ............................................ 73
3.5 Vesikelfusion ..................................................................................................... 81
4. Diskussion ................................................................................................................ 85
4.1 Neurexin ist Bestandteil von synaptic vesicle protein transport vesicles .......... 85
4.2 Cytoskelettabhängigkeit des Neurexin-Transports ............................................ 87
4.3 Mechanismus des intrazellulären Transports von Neurexin .............................. 88
4.4 Ausblick ............................................................................................................. 94
5. Zusammenfassung .................................................................................................... 97
6. Abstract .................................................................................................................... 98
7. Literaturverzeichnis ................................................................................................. 99
8. Abbildungsverzeichnis ........................................................................................... 118
9. Tabellenverzeichnis ............................................................................................... 119
10. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 120