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Charakterisierung der Interaktion von Dystroglycan mit Neurexin unter Einbeziehung der Wechselwirkungen mit weiteren Neurexin-Liganden

Neurexin (Nrxn) bindet über seine extrazelluläre Domäne an Dystroglycan (DAG). Über die Interaktion von Nrxn und DAG ist bisher wenig bekannt und die Auswirkungen auf den Nrxn-Neuroligin- (Nlgn-) Komplex sind unbeleuchtet. Mithilfe zielgerichteter Mutagenese und Ko-Sedimentationsstudien wurden die exakten Bindungsepitope von DAG auf den Nrxn-Domänen LNS2 und LNS6 bestimmt und gezeigt, dass DAG mit bekannten Nrxn-Liganden Neurexophilin (Nxph) und Nlgn konkurriert. DAG bindet ausschließlich an insert-freie LNS-Domänen. Unerwarteterweise behindert die DAG-Bindung an die LNS2 die Nlgn-Interaktion mit der LNS6 von Nrxn. Eine simultane Bindung von Nxph und DAG an Nrxn ist jedoch möglich. Die Expression von DAG und die verschiedenen Nrxn-splice-Varianten könnten die Ausbildung unterschiedlicher transsynaptischer Nrxn-Nlgn-Komplexe ermöglichen oder verhindern und so einen Mechanismus andeuten um die synaptische Identität in verschiedenen Entwicklungs- und Aktivitätszuständen zu bestimmen.

Titel: Charakterisierung der Interaktion von Dystroglycan mit Neurexin unter Einbeziehung der Wechselwirkungen mit weiteren Neurexin-Liganden
Verfasser: Stahn, Johanna GND
Gutachter: Missler, Markus
Organisation: FB 13: Biologie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 11.11.2013
Publikation in MIAMI: 11.11.2013
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: Dystroglycan; Neurexin; zielgerichtete Mutagenese; Adhäsion; Glykosylierung; molekulare Modellierung
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-55319413033
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-55319413033
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Inhalt:
I. Inhaltsverzeichnis ............................................................................................... I
II. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... IV
1. Einleitung ......................................................................................................... 1
1.1. Neurexine .......................................................................................................... 3
1.2. LNS-Domänen .................................................................................................. 6
1.3. Der Neurexin-Neuroligin-Komplex .................................................................. 9
1.3.1. Die Rolle des Neurexin-Neuroligin-Komplexes in Autismus-assoziierten
Erkrankungen .................................................................................................. 10
1.4. Dystroglycan ................................................................................................... 14
1.4.1. Struktur und Ligandenbindung von Dystroglycan .......................................... 15
1.4.2. Dystroglycan-Glykosylierung ......................................................................... 18
1.5. Dystroglycan als Komponente des Dystrophin-assoziierten
Glykoproteinkomplexes .................................................................................. 20
1.5.1. Der Dystrophin-assoziierte Glykoproteinkomplex im Skelettmuskel ............ 20
1.5.2. Der Dystrophin-assoziierte Glykoproteinkomplex an der Neuromuskulären
Endplatte ...................................................................................... 21
1.5.3. Der Dystrophin-assoziierte Glykoproteinkomplex im Gehirn ........................ 22
1.6. Zielsetzung der Arbeit ..................................................................................... 26
2. Material und Methoden ................................................................................ 27
2.1. Material .......................................................................................................... 27
2.1.1. Geräte .............................................................................................................. 27
2.1.2. Chemikalien .................................................................................................... 28
2.1.3. Oligonukleotide ............................................................................................... 29
2.1.4. Herstellung von Neurexin- und Dystroglycan-Expressionsvektoren .............. 31
2.1.5. Kits .................................................................................................................. 33
2.1.6. Antikörper ....................................................................................................... 33
2.1.7. Mauslinien ....................................................................................................... 34
2.1.8. Zelllinien ......................................................................................................... 34
2.1.9. Bakterienstämme ............................................................................................. 34
2.1.10. Nährmedien und Zusätze ................................................................................ 35
2.2. Molekularbiologische Methoden ................................................................. 35
2.2.1. Gezielte Mutagenese der Dystroglycan- und Neurexin-Expressionsvektoren
........................................................................................................... 35
2.2.1.1. Allgemeines Protokoll für Klonierungen ........................................................ 35
2.2.1.2. Allgemeines Protokoll für gezielte Mutagenesen ........................................... 36
2.2.2. Polymerase-Kettenreaktion ............................................................................. 37
2.2.3. In vitro Mutagenese nach dem QuikChange® lightning Protokoll ................. 38
2.2.4. Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen mit dem QIAEX® IIExtraktions-
Kit ................................................................................................ 39
2.2.5. Restriktionsendonuklease-Verdau von DNA .................................................. 40
2.2.6. Dephosphorylierung linearisierter Vektor-DNA ............................................ 40
2.2.7. Phenol-Chloroform-Aufreinigung von Vektor-DNA ..................................... 40
2.2.8. DNA-Aufreinigung über das DNA Clean&Concentrator™ -5 Kit ................ 41
2.2.9. Ligation von DNA-Fragment und Zielvektor ................................................. 41
2.2.10. Elektrotransformation von E.Coli XL1-Blue MRF ........................................ 42
Inhaltsverzeichnis
II
2.2.11. Isolation von Plasmid-DNA mithilfe der Express-Mini Präparation .............. 42
2.2.12. Isolation von high-copy Plasmid-DNA nach dem NucleoSpin®-Protokoll .... 43
2.2.13. Plasmid-DNA-Aufreinigung nach dem NucleoBond® -Verfahren ................. 43
2.2.14. Konzentrationsbestimmung aufgereinigter Plasmid-DNA .............................. 44
2.2.15. DNA-Sequenzierung ....................................................................................... 44
2.2.16. Agarose-Gelelektrophorese ............................................................................. 44
2.3. Zellbiologische Methoden ............................................................................. 45
2.3.1. Kryokonservierung und Rekultivierung von HEK tsA201, N2a und COS7 ... 45
2.3.2. Kultivierung von HEK tsA201- und N2a-Zellen ............................................ 45
2.3.3. Kultivierung von COS7-Zellen ....................................................................... 46
2.3.4. Transfektion von HEK tsA201- und N2a-Zellen nach der Kalzium-
Phosphat-Methode ........................................................................................... 46
2.3.5. Transfektion von COS7-Zellen mittels DEAE-Dextran-Methode .................. 47
2.3.6. Behandlung von N2a-Zellen mit Tunicamycin ............................................... 48
2.4. Proteinbiochemische Methoden ................................................................... 48
2.4.1. Lyse von Maushirnen ...................................................................................... 48
2.4.2. Vorexperimente zur Verifizierung von preclear und WGA ........................... 49
2.4.2.1. Reinigung von Maushirnlysat mittels preclear ............................................... 49
2.4.2.2. Akkumulation von Glykoproteinen aus Maushirnlysat über WGA ................ 49
2.4.3. Isolation von Fc-Fusionsproteinen aus HEK tsA201-Medium ....................... 50
2.4.4. Zelllyse von HEK tsA201, N2a und COS7 ..................................................... 50
2.4.5. Pulldown mithilfe Protein A-gekoppelter Fusionsproteine ............................. 50
2.4.6. Behandlung von Proteinkomplexen mit Dithiothreitol (DTT) ........................ 51
2.4.7. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese .......................................................... 52
2.4.8. Transfer von Proteinen auf Nitrozellulose (Western Blot) und Ponceau-S
Färbung ............................................................................................................ 53
2.4.9. Nachweis gebundener Proteine mittels Antikörper-Färbung .......................... 53
2.4.10. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford .................................... 54
2.5. Bioinformatische Methoden ......................................................................... 54
3. Ergebnisse ...................................................................................................... 57
3.1. Etablierung einer pulldown-Methode zur Durchführung von
Bindungsstudien .............................................................................................. 57
3.2. αDAG bindet an die Domänen αLNS2 und αLNS6 von Nrxn1α und
an Nrxn1β ........................................................................................................ 59
3.3. Die Zelllinie N2a ist eine Quelle für endogenes Dystroglycan ....................... 63
3.4. Kartierung der Bindungsstelle von αDAG auf der αLNS2 ............................ 64
3.5. Nxph1 und αDAG konkurrieren um die Bindung auf der αLNS2 ................. 67
3.6. αDAG und Nxph1 binden simultan an Nrxn1α ..............................................69
3.7. Die αDAG- und Nlgn-Bindungsstellen auf der αLNS6 sind überlappend,
aber differenzierbar ......................................................................................... 71
3.7.1. αDAG bindet direkt an die αLNS6 ................................................................. 71
3.7.2. Die αDAG-αLNS6 Interaktion ist splice-abhängig ........................................ 72
3.7.3. Kartierung der exakten Bindungsstelle von αDAG auf der αLNS6 ............... 74
3.8. αDAG und Nlgn konkurrieren um die Bindung an der αLNS6 ...................... 77
3.9. Die Bindung von αDAG an der αLNS2 von Nrxn1α verhindert die
Interaktion von Nlgn mit der αLNS6 .............................................................. 78
3.10. Vergleich der Bindungsaffinität von Nlgn1 und Nlgn2 an Nrxn1α ................ 81
3.11. Vergleich der Bindungscharakteristika von αLNS2 und αLNS6 ................... 82
Inhaltsverzeichnis
III
3.11.1. Die Kalzium-Koordinationsstelle der αLNS6 kann auf die αLNS2
übertragen werden, jedoch nicht umgekehrt ................................................... 82
3.11.2. Transfer der Kalzium-Koordination von der Laminin 2α LNS5 auf
die Nrxn1α-Domänen αLNS2 und αLNS6 .................................................... 84
3.12. Die Interaktion von αDAG und Nrxn ist Glykosylierungs-abhängig und
benötigt ein spezifisches Zuckermuster vermittelt durch LARGE ................. 85
3.12.1. N-verknüpfte Zucker sind an der Interaktion von αDAG und Nrxn
beteiligt ............................................................................................................ 85
3.12.2. LARGE ist notwendig für die Interaktion von αDAG und Nrxn ................... 87
3.13. Identifizierung der Nrxn-Bindungsstelle auf αDAG ...................................... 88
3.13.1. αDAG bindet Nrxn nicht wie Laminin ........................................................... 88
3.13.2. Die Mucin-ähnliche Region von αDAG vermittelt die Bindung an Nrxn ...... 89
4. Diskussion ...................................................................................................... 91
4.1. Der pulldown-Assay ist eine effiziente Methode zur Durchführung von
DAG-Bindungsstudien .................................................................................... 91
4.2. Die Nrxn1α-Konformation bestimmt die Ligandenbindung .......................... 93
4.3. Charakterisierung der DAG-Interaktion mit den Domänen αLNS2 und
αLNS6 ............................................................................................................. 94
4.4. Die Ausbildung von DAG-Nrxn Multikomplexen ist splice-abhängig ........ 100
4.5. DAG-Glykosylierung .................................................................................... 111
4.6. Ausblick ........................................................................................................ 115
5. Zusammenfassung ......................................................................................... 117
6. Abstract ......................................................................................................... 119
7. Literaturverzeichnis ...................................................................................... 121
8. Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 151
9. Tabellenverzeichnis ...................................................................................... 152
10. Anhang .......................................................................................................... 153