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Einfluss der S100A12-Oligomerisierung auf die Interaktion und Aktivierung der Rezeptoren RAGE und TLR-4

Das Kalzium-Bindeprotein S100A12 fungiert sowohl als Signalmolekül als auch als Biomarker bei verschiedenen (auto)inflammatorischen Erkrankungen. In Abwesenheit der Ionen Kalzium (Ca) und Zink (Zn) liegt es überwiegend als Dimer vor. Die Bindung von Ca und/oder Zn führt zu einer Konformationsänderung und damit zur Oligomerisierung. In dieser Arbeit wurden S100A12-Mutanten durch Substitution der an der Ca- oder Zn-Bindung beteiligten Aminosäuren (AS) erzeugt und auf ihre Komplexbildung sowie RAGE-/TLR-4-Bindung und -Aktivierung hin analysiert. Substitutionen der für die Zn-Bindung essentiellen AS haben weniger Einfluss auf die Komplexbildung als Mutationen der Ca-bindenden AS. Funktionelle Analysen der Mutanten zeigten, dass alle Komplexformen des S100A12 in der Lage sind, die Rezeptoren TLR-4 und RAGE zu binden. Bei Analysen zur Rezeptor-Aktivierung ist hingegen deutlich geworden, dass ausschließlich hexameres S100A12 in der Lage ist, eine Signaltransduktion über TLR 4 zu initiieren.

Titel: Einfluss der S100A12-Oligomerisierung auf die Interaktion und Aktivierung der Rezeptoren RAGE und TLR-4
Verfasser: Brockmeyer, Sonja GND
Gutachter: Föll, Dirk GND
Organisation: FB 13: Biologie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2016
Publikation in MIAMI: 15.02.2016
Datum der letzten Änderung: 15.02.2016
Schlagwörter: Kalzium-Bindeprotein; S100A12; Oligomerisierung; TLR-4; RAGE; Signaltransduktion
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-66289688763
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-66289688763
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Inhalt:
INHALTSVERZEICHNIS ..................................................................................... I
KAPITEL 1 - ZUSAMMENFASSUNG .................................................................... 5
KAPITEL 2 - EINLEITUNG ................................................................................ 7
2.1. Das Immunsystem ............................................................................................................... 7
2.1.1. Das angeborene Immunsystem ....................................................................................... 7
2.2. DAMPs .................................................................................................................................. 8
2.3. Die S100-Proteinfamile ........................................................................................................ 9
2.3.1. S100A12 ......................................................................................................................... 10
2.3.1.1. Struktur von S10012 ................................................................................................. 10
2.3.1.2. Bindung zweiwertiger Kationen durch S100A12 und deren Einfluss auf die Proteinstruktur und -funktion ..................................................................................... 11
2.3.1.3. Funktionen von S100A12 .......................................................................................... 15
2.4. TLRs .................................................................................................................................... 16
2.4.1. Signalleitung über TLR-4 ................................................................................................ 18
2.5. Zielsetzung ......................................................................................................................... 22
KAPITEL 3 - MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 23
3.1. Material ............................................................................................................................... 23
3.1.1. Allgemeine Chemikalien und Reagenzien ..................................................................... 23
3.1.2. Puffer und Lösungen ...................................................................................................... 24
3.1.3. Medien und Lösungen für die Zellkultur ......................................................................... 26
3.1.4. Medien zu Kultivierung von Bakterien ............................................................................ 27
3.1.5. Eukaryotische Zelllinien .................................................................................................. 28
3.1.6. Bakterienstämme ............................................................................................................ 28
3.1.7. Antibiotika ....................................................................................................................... 28
3.1.8. Proteine und Standards .................................................................................................. 28
3.1.9. Antikörper ....................................................................................................................... 29
3.1.9.1. Primäre Antikörper .................................................................................................... 29
3.1.9.2. Sekundäre Antikörper ............................................................................................... 30
3.1.10. sonstige Detektionsreagenzien .................................................................................... 30
3.1.11. Primersequenzen ......................................................................................................... 30
3.1.12. Vektoren ....................................................................................................................... 31
3.1.13. Enzyme ........................................................................................................................ 33
3.1.14. Kits und Protokolle ....................................................................................................... 34

3.1.15. Verbrauchsmaterialien .................................................................................................
34
3.1.16. Laborausstattung ......................................................................................................... 35
3.1.17. Software ....................................................................................................................... 36
3.2. Methoden ............................................................................................................................ 37
3.2.1. Zellkultur ......................................................................................................................... 37
3.2.1.1. Allgemeines ............................................................................................................... 37
3.2.1.2. Kultivierung von HEK293- und HEK293/TCM-Zellen ............................................... 37
3.2.1.3. Kultivierung von THP1-Zellen ................................................................................... 37
3.2.1.4. Kryokonservierung von Zellen .................................................................................. 38
3.2.1.5. Revitalisierung kryokonservierter Zellen ................................................................... 38
3.2.1.6. Zellzahlbestimmung .................................................................................................. 38
3.2.2. Arbeiten mit Escherichia coli (E. coli) ............................................................................. 38
3.2.2.1. Kultivierung von E. coli .............................................................................................. 38
3.2.2.2. Kryokonservierung von E. coli .................................................................................. 39
3.2.2.3. Herstellung chemisch kompetenter E. coli ................................................................ 39
3.2.2.4. Transformation chemisch kompetenter E. coli .......................................................... 39
3.2.3. Molekularbiologische Methoden ..................................................................................... 40
3.2.3.1. Präparation plasmidischer DNA ................................................................................ 40
3.2.3.2. Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA ....................................................... 40
3.2.3.3. Enzymatische Behandlung von DNA ........................................................................ 41
3.2.3.3.1. Analytische und präparative Restriktion .............................................................. 41
3.2.3.3.2. Ligation der mutierten S100A12-DNA in pEF-IRES ............................................ 41
3.2.3.4. Gelelektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten .......................................... 42
3.2.3.5. Nachweis der Genexpression ................................................................................... 43
3.2.3.6. Site-directed Mutagenesis ........................................................................................ 44
3.2.3.7. Sequenzierung .......................................................................................................... 45
3.2.3.8. Stabile Transfektion von HEK293-Zellen .................................................................. 45
3.2.4. Proteinbiochemische Methoden ..................................................................................... 46
3.2.4.1. Rekombinante Expression von Proteinen in HEK293-Zellen ................................... 46
3.2.4.2. Rekombinante Expression von Protein in E. coli BL21(DE3) ................................... 46
3.2.4.3. Aufreinigung der in E. coli exprimierten Proteine ...................................................... 47
3.2.4.3.1. Anionenaustauschchromatographie (AIEX) ........................................................ 47
3.2.4.3.2. Kalzium-abhängige hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ................. 48
3.2.4.4. Aufreinigung der in HEK293-Zellen exprimierten Proteine ....................................... 49
3.2.4.4.1. Konzentrationsbestimmung von Proteinen ......................................................... 49
3.2.4.5. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ........................................................ 50
3.2.4.6. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ............................................................... 51
3.2.4.6.1. Coomassie-Färbung ............................................................................................ 52
3.2.4.7. Westernblot (WB) ...................................................................................................... 52
3.2.4.8. Densitometrie ............................................................................................................ 53

3.2.4.9. Stimulation von HEK293/TCM-Zellen .......................................................................
53
3.2.4.10. Stimulation von THP1-Zellen .................................................................................. 53
3.2.4.11. Entfernung von LPS mittels EndoTrap ................................................................... 54
3.2.4.12. Bestimmung der LPS-Konzentration mittels EndoLISA .......................................... 54
3.2.4.13. Chemische Quervernetzung von Proteinen ............................................................ 55
3.2.4.14. Größenfiltration der Proteine ................................................................................... 56
3.2.5. Statistik ........................................................................................................................... 56
KAPITEL 4 - ERGEBNISSE ............................................................................... 57
4.1. Isolierung einzelner S100A12-Komplexe durch Größenfiltration ................................. 57
Zusammenfassung Abschnitt 4.1……………….………………………………………………….58
4.2. Herstellung von S100A12-Mutanten ................................................................................ 59
4.2.1. Site-directed Mutagenesis .............................................................................................. 59
4.2.2. Proteinexpression in Säugerzellen (HEK293) ................................................................ 61
4.2.3. Vergleich der Proteinexpression im Zytosol und in Einschlusskörpern von E. coli BL21(DE3) ...................................................................................................................... 62
4.2.4. Proteinaufreinigung aus E. coli BL21(DE3) .................................................................... 64
4.2.4.1. Anionenaustauschchromatographie ......................................................................... 64
4.2.4.2. Etablierung der HIC-Aufreinigung für die S100A12-Mutanten .................................. 66
4.2.4.3. Entfernung von Endotoxinen ..................................................................................... 74
4.2.4.4. Qualitätskontrolle der aufgereinigten Proteine .......................................................... 74
Zusammenfassung Abschnitt 4.2……………….………………………………………………….76
4.3. Bindungsverhalten mono- und polyklonaler Antikörper ............................................... 77
Zusammenfassung Abschnitt 4.3…………………………………………………………………..81
4.4. Analyse der Komplexbildung ........................................................................................... 81
4.4.1. Kalzium- und Zink-abhängige Oligomerisierung von wtS100A12 .................................. 81
4.4.2. Kalzium- und Zink-abhängige Oligomerisierung der Kalziumbindungs-Mutanten ......... 82
4.4.3. Kalzium- und Zink-abhängige Oligomerisierung der Zinkbindungs-Mutanten ............... 84
Zusammenfassung Abschnitt 4.4………………………….……………………………………….86
4.5. Funktionelle Analysen der S100A12-Mutanten .............................................................. 87
4.5.1. Das S100A12-Hexamer zeigt die effektivste Bindung an TLR-4 und RAGE ................. 87
4.5.2. Analyse der Protein-TLR-4-Interaktion im ELISA ........................................................... 88
4.5.3. Analyse der Protein-RAGE-Interaktion im ELISA .......................................................... 90
4.5.4. TLR-4 vermittelte Stimulation von HEK293/TCM-Zellen ................................................ 91
4.5.5. TLR-4 vermittelte Stimulation von THP1-Makrophagen................................................. 93
4.5.6. Stimulation von THP1-Makrophagen in Anwesenheit eines TLR-4 Antikörpers ............ 96
Zusammenfassung Abschnitt 4.5…………………………………………………………………..98
KAPITEL 5 - DISKUSSION ............................................................................... 99
5.1. Darstellung verschiedener S100A12-Komplexformen .................................................. 99
5.1.1. Aminosäureaustausch durch Site-directed Mutagenesis ............................................... 99

5.1.1.1. Die Mutationen der Kalzium- und Zink-bindenden AS haben unterschiedliche Einflüsse auf die tertiäre bzw. quaternäre Proteinstruktur ......................................
101
5.2. Charakterisierung der extrazellulären S100A12-Rezeptor-Interaktion ...................... 106
5.2.1. Die Rezeptorbindung ist unter extrazellulären Bedingungen am effizientesten .......... 106
5.2.2. Alle S100A12-Mutanten können die Rezeptoren TLR-4 und RAGE binden ................ 107
5.2.3. Hexameres S100A12 ist für die Signalweiterleitung über TLR-4 essentiell ................. 108
5.2.4. Stimulation der THP1-Makrophagen nach TLR-4 Blockade ........................................ 111
5.3. Schlussfolgerung und Ausblick..................................................................................... 112
KAPITEL 6 - LITERATURVERZEICHNIS ............................................................... 115
KAPITEL 7 - ANHANG ................................................................................. 126
7.1. Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 126
7.2. Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 130
7.3. Tabellenverzeichnis ........................................................................................................ 131
7.4. Weitere Tabellen und Abbildungen ............................................................................... 132
7.5. Eidesstattliche Erklärung ............................................................................................... 135