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Humane Hyaluronidasen als Wirkstofftargets

rekombinante Expression, Aktivitätsbestimmung und Testung von Substanzen

In dieser Arbeit wurde die Aktivität der hPH-20 und hHyal-1 als Teil eines Autodisplay-Fusionsproteins untersucht. Es wurden Außenmembran-Vesikel (AMV) aus E. coli JC8031 zur Enzymmessung eingesetzt. Sie wurden in ihren Eigenschaften charakterisiert. Anschließend wurden die AMV zur Enzymmessung eingesetzt und es ergab sich im photometrischen Testverfahren eine katalytische Aktivität von 582 mU/mL. Im Weiteren wurde eine kapillarelektrophoretische Methode zur Analytik der Hyaluronidase-Aktivität etabliert. Im Anschluss wurden Testsubstanzen auf Hemmung der hPH-20 hin geprüft. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Enzymaktivität der hHyal-1 als Autotransporter-Fusionsprotein untersucht. Die hHyal-1 tragenden E. coli Zellen zeigten eine gut nachweisbare Aktivität von 76,56 U/mL (OD578 von 10) und wurden zur Identifizierung von Hemmstoffen eingesetzt. Es wurden drei Saponin-Derivate, Gypsophila Saponin 2, SA1657 und SA1641, als neue Hemmstoffe der hHyal-1 identifiziert.

Titel: Humane Hyaluronidasen als Wirkstofftargets
Untertitel: rekombinante Expression, Aktivitätsbestimmung und Testung von Substanzen
Verfasser: Orlando, Zoya GND
Gutachter: Jose, Joachim
Organisation: FB 12: Chemie und Pharmazie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2015
Publikation in MIAMI: 17.04.2015
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: Hyaluronsäure; Hyaluronidasen; Autodisplay; Inhibitortestung; rekombinante Expression
Fachgebiete: Chemie; Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-19299344250
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-19299344250
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Inhalt:
Zusammenfassung ..................................................................................................... 1
Summary .................................................................................................................... 3
I Einleitung .................................................................................................................. 5
1 Hyaluronsäure (HA) ................................................................................................. 5
1.1 Aufbau und Vorkommen ................................................................................... 5
1.2 (Patho)physiologische Bedeutung der HA ........................................................ 6
1.3 Medizinische Anwendung ................................................................................. 8
2 Hyaluronidasen ........................................................................................................ 9
2.1 Klassifikation der Hyaluronidasen ..................................................................... 9
2.2 Humane Hyaluronidasen ................................................................................... 9
2.3 Hyaluronidasen als Wirkstofftargets ................................................................ 14
2.4 Hemmstoffe der Hyaluronidasen ..................................................................... 17
3 Analytik der HA und Hyaluronidase-Aktivität ......................................................... 21
3.1 Photometrische Methoden .............................................................................. 21
3.2 Kapillarelektrophoretische Methoden .............................................................. 22
3.3 Chromatographische Methoden ...................................................................... 23
3.4 Weitere Bestimmungsverfahren ...................................................................... 24
4 Rekombinante Expression von Hyaluronidasen .................................................... 25
4.1 Autodisplay ..................................................................................................... 26
5 Ziele der Arbeit ...................................................................................................... 29
II Material und Methoden .......................................................................................... 30
1 Materialien ............................................................................................................. 30
1.1 Geräte ............................................................................................................. 30
1.2 Chemikalien und Materialien ........................................................................... 31
1.3 Bakterienstämme ............................................................................................ 33
1.4 Oligonukleotide ............................................................................................... 33
1.5 Plasmide ......................................................................................................... 34
1.6 Antikörper ........................................................................................................ 35
1.7 Enzyme ........................................................................................................... 35
1.8 Nährmedien .................................................................................................... 35
1.9 Puffer und Lösungen ....................................................................................... 36
1.10 Reagenziensätze .......................................................................................... 38
1.11 Auswerteprogramme ..................................................................................... 38
2 Methoden ............................................................................................................... 38
2.1 Arbeiten mit Bakterien ..................................................................................... 38
2.1.1 Kultivierung ................................................................................................ 38
2.1.2 Herstellen elektrokompetenter Zellen ........................................................ 39
2.1.3 Transformation elektrokompetenter Zellen ................................................ 39
2.1.4 Herstellen chemisch kompetenter Zellen ................................................... 39
2.1.5 Transformation chemisch kompetenter Zellen ........................................... 40
2.1.6 Stammhaltung ........................................................................................... 40
2.1.7 Proteinexpression und Zellernte ................................................................ 40
2.1.8 Anreicherung von Außenmembran-Vesikeln (AMV) .................................. 41
2.1.9 Lysogenisierung von E. coli ....................................................................... 42
2.1.10 Elektronenmikroskopische Aufnahmen ................................................... 42
2.1.11 Nachweis von Heptasaccharid-produzierendem E. coli ........................... 43
2.2 Arbeiten mit Nukleinsäuren ............................................................................. 44
2.2.1 Plasmidisolierung ...................................................................................... 44
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion ....................................................................... 44
2.2.3 ‚‚In-Fusion‘‘ Klonierung .............................................................................. 45
2.2.4 Agarosegelelektrophorese und Färbung der DNA ..................................... 45
2.2.5 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegel ..................................... 45
2.2.6 Enzymatische Spaltung von DNA .............................................................. 45
2.2.7 Ligation und Entsalzen der DNA-Lösungen ............................................... 46
2.2.8 DNA-Sequenzanalyse ............................................................................... 46
2.3 Arbeiten mit Proteinen ..................................................................................... 46
2.3.1 Anreicherung der Außenmembranproteine ............................................... 46
2.3.2 Proteasesensitivität der oberflächenständigen Proteine ............................ 47
2.3.3 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ....... 48
2.3.4 Proteinanalyse mittels Western Blot und Immunfärbung ........................... 48
2.3.5 Intrazelluläre Expression und Aufreinigung der humanen PH-20 .............. 49
2.3.6 FRET-gestützter Nachweis der OmpT-Aktivität ......................................... 50
2.4 Nachweis der Hyaluronidase-Aktivität ............................................................. 50
2.4.1 Photometrische Methoden ......................................................................... 50
2.4.2 CE-gestützter Aktivitätstest ....................................................................... 52
III Experimente und Ergebnisse ................................................................................ 53
1 Autodisplay der humanen Hyaluronidase PH-20 (hPH-20) und Aktivitätsuntersuchungen mittels Ganzzell-Verfahren .............................................. 53
1.1 Autodisplay und Aktivitätsuntersuchungen der hPH-20 nach konstitutiver Expression ............................................................................................................ 53
1.1.1 Autodisplay der um die GPI-Anker-Erkennungssequenz verkürzten hPH-20 ........................................................................................................................... 60
1.2 Autodisplay und Aktivitätsuntersuchungen der hPH-20 nach einer araBAD-Promotor kontrollierten Expression ....................................................................... 68
2 Intrazelluläre Expression der hPH-20 .................................................................... 73
2.1 Aufreinigung und Untersuchung der intrazellulär exprimierten hPH-20........... 74
3 Autodisplay der hPH-20 in E. coli JC8031 ............................................................. 76
3.1 Charakterisierung der hPH-20-tragenden Außenmembran-Vesikeln (AMV) ... 77
3.2 Aktivitätsuntersuchung der hPH-20-tragenden AMV mittels ‚‚Stains-all‘‘-Verfahren .............................................................................................................. 92
3.3 Turbidimetrische Aktivitätsuntersuchungen der hPH-20-tragenden AMV ....... 93
3.4 Kapillarelektrophoretische Analytik der HA und der Hyaluronidase-Aktivität ... 94
3.4.1 Kapillarelektrophoretische Messung der Enzymaktivität mit AMV ............. 97
3.5 Testung von Hemmstoffen ............................................................................ 103
4 Autodisplay der humanen Hyaluronidase Hyal-1 (hHyal-1) ................................. 107
4.1 Oberflächenständigkeit der hHyal-1 .............................................................. 107
4.2 Aktivität der oberflächenständigen hHyal-1 ................................................... 109
4.3 Identifizierung von pflanzlichen Inhaltsstoffen als Hemmstoffe der hHyal-1 .. 113
5 Untersuchungen zur N-Glykosylierung von Hyaluronidasen als Autotransporter-Fusionsproteine ...................................................................................................... 117
5.1 N-Glykosylierung der hPH-20 in E. coli ......................................................... 118
5.2 N-Glykosylierung der hHyal-1 in E. coli ......................................................... 121
IV Diskussion .......................................................................................................... 127
1 Autodisplay der humanen Hyaluronidase PH-20 (hPH-20) .................................. 127
1.1 Testung von hPH-20-Fusionsprotein............................................................. 127
1.2 Intrazelluläre Expression der hPH-20 ............................................................ 129
1.3 Aktivitätstest mittels Außenmembran-Vesikeln (AMV) .................................. 129
2 Autodisplay der humanen Hyaluronidase Hyal-1 ................................................. 133
3 Untersuchungen zur Glykosylierung des Autotransporter-Fusionsproteins ......... 137
4 Fazit ..................................................................................................................... 140
V Literaturverzeichnis ............................................................................................. 141
VI Anhang ............................................................................................................... 158
1 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 158
2 Sequenzen .......................................................................................................... 160
3 Plasmidkarten ...................................................................................................... 162
4 Veröffentlichungen ............................................................................................... 163