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Funktion von Vac14 in humanen Podozytenzelllinien

Untersucht wurde eine Verbindung von Vac14, das als Regulator von Fusionierung und Abspaltung endosomaler Vesikel auftritt, und PATJ, das in enger Assoziation mit Polarität und apikalem endosomalem trafficking steht. Interaktionsprüfungen beider Proteine konnten nun anhand von Immunfluoreszenzstudien an Podozyten bestätigt werden. Dabei zeigte sich ein massiver Vakuolisierungsphänotyp. Für eine nähere Untersuchung wurden Vac14wt Zellen und generierte Mutations-Zelllinien von Vac14 verwendet. Durch den Vergleich der Vac14-Varianten konnte der Vakuolenphänotyp auf einen C-terminalen Proteinabschnitt eingegrenzt werden. Betroffene Zellen zeigten Effekte bezüglich der Quantität von Markerproteinen, sowie Eigenschaften der Vakuolen, die im Zusammenhang mit Endolysosomen und Autophagozytose stehen. Vakuolen scheinen sich auf das Zytoskelett auszuwirken und negative Effekte bei Migration zu spielen. Vakuolisierungen scheinen in Spätstadien von glomerulären Erkrankungen relevant zu sein.

Titel: Funktion von Vac14 in humanen Podozytenzelllinien
Verfasser: Kluitmann, Jens GND
Gutachter: Pavenstädt, Hermann GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 20.02.2014
Publikation in MIAMI: 20.02.2014
Datum der letzten Änderung: 20.02.2014
Schlagwörter: Podozyt; PATJ; Vac14; Endosomen; Vakuole; Polarität; Autophagozytose
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-34319446394
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-34319446394
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Inhalt:
1 Einleitung ......................................................................................... 1
1.1 Allgemeine Einführung zur Niere und den Podozyten.............................. 1
1.2 Der Podozyt in der Filtrationseinheit des Glomerulums .......................... 3
1.2.1 Architektur des Podozyten.............................................................. 3
1.2.2 Podozyten und Schlitzmembran/Glomeruläre Basalmembran ..... 4
1.2.3 Polarität bei Podozyten .......................................................... 6
1.3 Das Protein PATJ ....................................................................... 7
1.4 Das Protein Vac14, Komplexproteine und Regulationsvorgänge .......... 9
1.4.1 Vac14 ................................................................................. 9
1.4.2 Vac14-Komplex ...........................................................................10
1.4.3 Endosomen, Lysosomen, Autophagozytose ...................................12
1.5 Zielsetzung der Arbeit ..................................................................13
2 Material ........................................................................................... 15
2.1 Geräte ......................................................................................15
2.2 Chemikalien ..............................................................................16
2.3 Laborbedarf ............................................................................17
2.4 Puffer und Lösungen ...................................................................19
2.5 Medien .....................................................................................20
2.5.1 Medien zur Kultivierung von Bakterien ....................................21
2.5.2 Medien zur Kultivierung eukaryoter Zellen .......................................21
2.6 Kits und Reagenziensysteme .................................................22
2.7 Enzyme ......................................................................................22
2.8 Antikörper ..............................................................................23
2.8.1 Primäre Antikörper ..............................................................23
2.8.2 Sekundäre Antikörper ...........................................................23
2.9 Software und Internetprogramme ......................................................24
2.10 Organismen..............................................................................25
2.10.1 Bakterien ..................................................................................25
2.10.2 Eukaryotische Zellen ..................................................................25
2.11 Plasmide und Vektoren ...........................................................26
2.12 Primer ................................................................................27
3 Methoden ....................................................................................... 28
3.1 Molekularbiologische Methoden ..........................................................28
3.1.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................28
3.1.2 Klonierung von DNA-Fragmenten....................................................29
3.1.3 Sequenzierung von DNA .............................................................32
3.1.4 Durchführung von Mutagenesen ..................................................33
3.2 Mikrobiologische Methoden ...............................................................35
3.2.1 Kultivierung von Bakterien .....................................................35
3.2.2 Herstellung kompetenter Bakterien ....................................35
3.2.3 Transformation von Bakterien ...............................................36
3.3 Zellbiologische Methoden .............................................................36
3.3.1 Kultivierung eukaryoter Zellen ..............................................36
3.3.2 Einfrieren und Auftauen eukaryotischer Zellen .........................37
3.3.3 Transfektion eukaryoter Zellen ...................................................37
3.3.4 Retroviraler Gen-Transfer und Expression ...................................38
3.3.5 Herstellung von Zelllysat ..............................................................39
3.3.6 Wound Healing Assay ...........................................................40
3.4 Proteinbiochemische Methoden ..............................................41
3.4.1 Konzentrationsbestimmung proteinhaltiger Lösungen ................41
3.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) .................41
3.4.3 Western Blot .......................................................................42
3.4.4 Immunologischer Nachweis von Proteinen ....................................43
3.4.5 Entfernung membrangebundener Antikörper ..............................44
3.5 Mikroskopische Methoden .............................................................44
3.5.1 Immunfluoreszenzanalysen ..............................................44
3.5.2 Analyse mittels Lysotracker .................................................45
4 Ergebnisse ..................................................................................... 47
4.1 Nachweis von Vac14 in Podozyten .................................................47
4.2 PATJ-Vac14 Interaktion ............................................................48
4.3 Vac14 und Vakuolen in Podozyten ..............................................50
4.3.1 Vac14 und Zytoskelett ...........................................................53
4.3.2 Perinukleäres Auftreten von Vakuolen in Vac14-Zellen .............54
4.4 Einführende Migrationsstudie ......................................................54
4.5 Genauere Charakterisierung der Vakuolen ...........................................56
4.6 Untersuchungen bezüglich des lysosomalen Charakters .................61
4.6.1 Intravakuoläre Strukturen in Vac14wt Zellen ...........................62
4.7 Übersicht über die Ergebnisse .........................................63
5 Diskussion ..................................................................................... 64
5.1 Die Interaktion Vac14/PATJ .....................................................64
5.2 Kultivierte Podozyten mit Vac14-Überexpression .........................65
5.2.1 Betrachtung des Effektes der Vac14 L156R Mutante ..................66
5.2.2 Warum treten Vakuolen in Vac14wt auf? ..................................66
5.2.3 Was passiert bei Unterbindung einer Bindung von Fig4 an Vac14? ......67
5.2.4 Verbindung von Vakuolisierungsprozess und Vac14 ..............68
5.3 Genauere Charakterisierung der Vakuolen ...................................71
5.3.1 Wie stehen die Vakuolen in Beziehung zu Autophagie? ...................74
5.4 Einfluss von Vac14 auf das Zytoskelett .......................................76
5.4.1 Größe der Vakuolen und Deformität der Zellen ............................77
5.4.2 Auswirkungen von Strukturveränderungen durch Vac14 auf den
Podozyten .................................................................................77
6 Ausblick ......................................................................................... 79
7 Vorstellung des Themas und Förderung ..................................... 81
8 Literaturverzeichnis ...................................................................... 82
9 Lebenslauf ..................................................................................... 90
10 Danksagung ................................................................................... 93