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Die Regulation der Alpha-Galaktosidase A

ein komplementärer Ansatz aus funktionellen Analysen und klinischer Charakterisierung

Morbus Fabry ist eine Multisystemerkrankung mit typischen neurologischen Manifestationen welche durch Mutationen im alpha-Galactosidase A (GLA)-Gen verursacht werden und zu einer enzymatischen Defizienz führen. Die Bedeutung nicht-kodierender Mutationen auf die Pathogenese ist unklar. Diese Arbeit zeigt, dass Träger des GLA-Haplotypen -10C>T [rs2071225], IVS2-81_-77delCAGCC [rs5903184], IVS4-16A>G [rs2071397] und IVS6-22C>T [rs2071228] unter Fabry-typischen neurologischen Manifestationen leiden. Das durchschnittliche GLA-mRNA Expressionsniveau der untersuchten Patienten war durchschnittlich um ~70% reduziert, gleichzeitig konnte ein dosisabhängiger Effekt des -10T-Allels nachgewiesen werden. Das -10T-Allel führt zu reduzierter Transkriptionsaktivität sowie veränderter Transkriptionsfaktor-Bindung. Eine funktionelle Relevanz der gekoppelten intronischen Varianten wurde durch Exon-Trapping ausgeschlossen. Das -10T-Allel kann Ursache der beobachteten neurologischen Manifestationen sein.

Titel: Die Regulation der Alpha-Galaktosidase A
Untertitel: ein komplementärer Ansatz aus funktionellen Analysen und klinischer Charakterisierung
Weitere Titel Die Regulation der alpha-Galaktosidase A
Verfasser: Schelleckes, Michael GND
Gutachter: Brand, Eva
Organisation: FB 13: Biologie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2014
Publikation in MIAMI: 21.10.2014
Datum der letzten Änderung: 21.10.2014
Schlagwörter: Morbus Fabry; alpha-Galaktosidase A; Genregulation; TFEB; neuropathische Schmerzen; Schlaganfall; SFN
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie; Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-01379569268
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-01379569268
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Inhalt:
Abkürzungen....……………………………………………….………….. I
Abstract ……………………………………………………………………VI
1. Einleitung……………………………………………………………… 1
1.1 Lysosomale Speichererkrankungen……………………………………… 1
1.2 Morbus Fabry………………………………………………………………….. 2
1.2.1 Genetik und Vererbung …………………………………………………………. 3
1.2.2 Pathogenese……………………………………………………………………… 5
1.2.3 Klinischer Verlauf des „klassischen“ Morbus Fabry………………………….. 6
1.2.4 Diagnostik und Therapie………………………………………………………… 8
1.2.5 Atypische Morbus Fabry Phänotypen…………………………………………. 10
1.3 Eukaryotische Genexpression……………………………………………... 11
1.3.1 Cis-regulatorische Elemente……………………………………………………. 11
1.3.2 Der Core-Promotor………………………………………………………………. 12
1.3.3 Die eukaryotische Transkriptionsmaschinerie…………………………………13
1.3.4 Der Transkriptionszyklus………………………………………………………... 14
1.3.5 Proximale Promotor-Elemente …………………………………………………. 14
1.3.6 Distale regulatorische-Elemente……………………………………………….. 15
1.3.7 Bidirektionale Promotoren………………………………………………………. 16
1.3.8 Eukaryotische Genregulation und humane Erkrankungen………………….. 17
1.4 Ziel der Arbeit…………………………………………………………………..17
2. Material…………………………………………………………………. 19
2.1 Chemikalien……………………………………………………………………. 19
2.2 Verbrauchsmaterialien und Kits…………………………………………… 20
2.3 Seren und Medien…………………………………………………………….. 21
2.4 DNA-Größenstandards………………………………………………………. 21
2.5 Enzyme und Antibiotika……………………………………………………... 22
2.6 Antikörper……………………………………………………………………… 22
2.7 Plasmide und Vektoren……………………………………………………… 22
2.8 Escherichia coli (E. coli)-Stämme…………………………………………. 23
2.9 Eukaryotische Zelllinien…………………………………………………….. 23
2.10 Geräte…………………………………………………………………………. 23
3. Methoden………………………………………………………………. 25
3.1 Molekularbiologische Methoden…………………………………………… 25
3.1.1 Isolation von Nukleinsäuren……………………………………………………. 25
3.1.1.1 Extraktion genomischer DNA…………………………………………25
3.1.1.2 Extraktion der Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen………………. 25
3.1.1.3 Extraktion der Gesamt-RNA aus Vollblut………………………….. 25
3.1.1.4 Isolation der Plasmid-DNA im kleinen Maßstab
(Mini-Präparation)……………………………………………………... 25
3.1.1.5 Isolation der Plasmid-DNA im großen Maßstab
(Maxi-Präparation)…………………………………………………….. 26
3.1.2 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration…………….. 26
3.1.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)…………………………………………… 26
3.1.3.1 Touchdown-PCR………………………………………………………… 27
3.1.3.2 Nested-PCR……………………………………………………………… 27
3.1.3.3 Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)……. 28
3.1.3.4 Real-time PCR…………………………………………………………… 28
3.1.4 Rapid amplification of 5′-cDNA ends (5′-RACE)……………………………… 29
3.1.5 DNA/RNA-modifizierende Reaktionen………………………………………… 29
3.1.5.1 Restriktionsendonukleasen…………………………………………….. 29
3.1.5.2 Dephosphorylierung von DNA…………………………………………. 29
3.1.5.3 Ligation…………………………………………………………………… 29
3.1.5.4 Biotinylierung der 3´-Enden einzelsträniger DNA-Oligonukleotide… 30
3.1.5.5 Zielgerichtete Mutagenese……………………………………………... 30
3.1.6 Agarose-Gelelektrophorese…………………………………………………….. 31
3.1.7 Aufreinigung von Nukleinsäuren………………………………………. ……… 32
3.1.7.1 Gelextraktion…………………………………………………………….. 32
3.1.7.2 DNA-Fällung……………………………………………………………... 32
3.1.7.3 Exo-SAP-Aufreinigung………………………………………………….. 32
3.1.7.4 Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion ……………………….. 32
3.1.8 Sequenzierung…………………………………………………………………… 33
3.1.9 Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)……………………………………….. 33
3.1.10 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)………………………………… 34
3.1.11 Exon-Trapping………………………………………………………………….. 35
3.1.12 Generierung serieller Promotordeletionskonstrukte………………………... 36
3.1.13 Reportergenassay……………………………………………………………… 39
3.1.13.1 Bidirektionaler Reportergenassay……………………………………. 39
3.2 Protein-biochemische Methoden………………………………………….. 40
3.2.1 Isolierung von Kernproteinen…………………………………………………… 40
3.2.2 Bestimmung der Proteinkonzentration ………………………………………… 41
3.2.3 Western-Blot (Tank-Blot)………………………………………………………... 41
3.3 Zellbiologische und mikrobiologische Methoden………………………... 42
3.3.1 Prokaryotische Zellen…………………………………………………………….42
3.3.1.1 Kulturbedingungen……………………………………………… ……… 42
3.3.1.2 Herstellung chemisch kompetenter E. coli……………………………. 42
3.3.1.3 Transformation kompetenter E. coli…………………………………… 43
3.3.2 Eukaryotische Zellen…………………………………………………………….. 43
3.3.2.1 Kulturbedingungen………………………………………………………. 43
3.3.2.2 Lagerung…………………………………………………………………. 43
3.3.2.3 Transiente Transfektion………………………………………………… 44
3.4 Statistische Auswertung…………………………………………………….. 44
3.5 Studienpopulationen…………………………………………………………. 44
3.6 In silico Analysen zur Vorhersage putativer TFBS……………………... 45
4. Ergebnisse……………………………………………………………... 46
4.1 Genomischer Aufbau der alpha-Galaktosidase A und
Lokalisation der Transkriptionsstartstelle………………………………. 46
4.2 Identifizierung transkriptionell aktiver Regionen
im 5´-flankierenden Bereich der GLA …………………………………….. 46
4.2.1 Potentielle Enhancer-Funktion des distalen Promotorbereichs…………….. 49
4.2.2 Bidirektionale Regulation durch duale Promotorfunktion……………………. 50
4.3 Einfluss der 5´-UTR auf die GLA-Transkriptionsaktivität ……………... 53
4.4 Beteiligung des Transkriptionsfaktors EB an der GLA-Regulation…. 54
4.4.1 Nachweis der endogenen TFEB-Bindung an GLA-Promotorbereiche
durch Chromatin-Immunopräzipitation ………………………………………… 56
4.5 Identifizierung genetischer Varianten im GLA-Promotor……………… 57
4.5.1 Einfluss der genetischen Variante -10C>T auf die Transkriptionsaktivität… 58
4.5.2 In silico-Analysen der Variante -10C>T……………………………………… 59
4.5.3 Das minore -10T-Allel führt zu einem veränderten
DNA-Protein-Bindungsmuster………………………………………………….. 61
4.6 Klinische Bedeutung des minoren -10T-Allels………………………….. 63
4.6.1 Der -10T-Haplotyp………………………………………………………………. 63
4.6.2 Das minore -10T-Allel ist mit neurologischen Manifestationen assoziiert…. 63
4.6.3 Das -10T-Allel führt zu einer verminderten GLA-Expression in
humanen Leukozyten……………………………………………………………. 69
4.6.4 Einfluss intronischer Varianten auf die mRNA-Prozessierung……………… 70
5. Diskussion……………………………………………………………... 73
5.1 Charakterisierung des GLA-Promotors und Einfluss der Variante
-10C>T auf die Genexpression……………………………………………… 73
5.2 Einfluss der 5´-untranslatierten Region auf die GLA-Expression…… 74
5.3 Regulation der GLA durch den Transkriptionsfaktor EB……………… 75
5.4 Mögliche Interaktion von TFEB mit der GLA 5´-UTR…………………… 77
5.5 Klinische Bedeutung und funktionelle Analyse von -10T…………….. 77
5.6 Zusammenfassung…………………………………………………………… 79
6. Ausblick………………………………………………………………… 82
7. Referenzen……………………………………………………………... 83
8. Kongressbeiträge…………………………………………………….. 95
9. Publikationen………………………………………………………….. 95