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Quantification with Comparative Fluorescence Gel Electrophoresis (CoFGE)

Comparative two-dimensional fluorescence gel electrophoresis (CoFGE) was developed to enable reproducibility of coordinate assignment for protein spots. To that end, it uses an internal grid formed by a set of pure proteins. The composition of the reference compounds is known, so that, in addition to the use of the marker nodes as anchors for gel warping, their fluorescence signal can serve to estimate the amount of protein present in an analyte gel spot of interest. Here, experimental data are provided to that effect. The reference mixture was distributed in five concentrations across the gel, thus allowing the generation of calibration curves for each marker protein. Quantification was evaluated using replicate separations of Escherichia coli lysate. Expectedly, the method worked best for well-defined proteins spots and could then be performed at less than 20% error. A suitable protein mixture (8-97 kDa) has been composed for this purpose. An abundance of reference slots (40) allows the user to alternate the concentration of the protein marker mix on the gel so that areas of gel distortion can be excluded from the calculation.

Die Vergleichende zweidimensionale Fluoreszenz Gelelektrophorese (CoFGE) wurde entwickelt, um eine reproduzierbare Zuordnung der Protein-Spotkoordinaten zu ermöglichen. Dazu wird ein internes Gitter verwendet, das durch eine Mischung reiner Proteine gebildet wird. Da die Zusammensetzung der Referenzsubstanzen bekannt ist, kann ihr Fluoreszenzsignal, zusätzlich zur Verwendung für das Gel-Warping, genutzt werden, um die Menge des im Analytenspot vorhandenen Proteins zu bestimmen. Dazu werden hier experimentelle Daten gezeigt. Die Referenzmischung wurde in fünf Konzentrationen über das Gel verteilt, so dass die Erstellung von Kalibrierkurven für jedes Marker-Protein möglich wurde. Die Quantifizierung wurde an Replikattrennungen von Escherichia coli-Lysat evaluiert. Wie zu erwarten, funktionierte das Verfahren am besten für gut definierte Proteinspots; es konnte dann mit weniger als 20% Fehler durchgeführt werden. Eine geeignete Proteinmischung (8-97 kDa) wurde dafür entwickelt. Die Vielzahl der Referenz-Aufgabepunkte (40) gestattet es dem Nutzer, die Proteinkonzentration der Marker auf dem Gel abzuwechseln, so dass Verzerrungen auf dem Gel von der Berechnung ausgeschlossen werden können.

Titel: Quantification with Comparative Fluorescence Gel Electrophoresis (CoFGE)
Verfasser: Nippes, Alina
Ackermann, Doreen GND
König, Simone GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Artikel
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: Mai 2019
Publikation in MIAMI: 17.05.2019
Datum der letzten Änderung: 17.05.2019
Zeitschrift/Periodikum: Mercator Journal of Biomolecular Analysis / 3 (2019) 1, S. 14 - 21
Schlagwörter: comparative fluorescence gel electrophoresis; CoFGE; protein coordinates; reference grid; internal standard; quantification
Vergleichende Fluoreszenz Gelelektrophorese; CoFGE; Proteinkoordinaten; Referenzgitter; interner Standard; Quantifizierung
Fachgebiete: Biochemie
Lizenz: CC BY-SA 3.0 DE
Sprache: Englisch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-74199681152
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-74199681152
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