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|a 570 Biowissenschaften; Biologie
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|a Brockmeyer, Sonja
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|a Universitäts- und Landesbibliothek Münster
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|a Einfluss der S100A12-Oligomerisierung auf die Interaktion und Aktivierung der Rezeptoren RAGE und TLR-4
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|a [Electronic ed.]
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| 264 |
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|c 2016
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| 264 |
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2 |
|b Universitäts- und Landesbibliothek Münster
|c 2016-02-15
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|a INHALTSVERZEICHNIS ..................................................................................... I -- KAPITEL 1 - ZUSAMMENFASSUNG .................................................................... 5 -- KAPITEL 2 - EINLEITUNG ................................................................................ 7 -- 2.1. Das Immunsystem ............................................................................................................... 7 -- 2.1.1. Das angeborene Immunsystem ....................................................................................... 7 -- 2.2. DAMPs .................................................................................................................................. 8 -- 2.3. Die S100-Proteinfamile ........................................................................................................ 9 -- 2.3.1. S100A12 ......................................................................................................................... 10 -- 2.3.1.1. Struktur von S10012 ................................................................................................. 10 -- 2.3.1.2. Bindung zweiwertiger Kationen durch S100A12 und deren Einfluss auf die Proteinstruktur und -funktion ..................................................................................... 11 -- 2.3.1.3. Funktionen von S100A12 .......................................................................................... 15 -- 2.4. TLRs .................................................................................................................................... 16 -- 2.4.1. Signalleitung über TLR-4 ................................................................................................ 18 -- 2.5. Zielsetzung ......................................................................................................................... 22 -- KAPITEL 3 - MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 23 -- 3.1. Material ............................................................................................................................... 23 -- 3.1.1. Allgemeine Chemikalien und Reagenzien ..................................................................... 23 -- 3.1.2. Puffer und Lösungen ...................................................................................................... 24 -- 3.1.3. Medien und Lösungen für die Zellkultur ......................................................................... 26 -- 3.1.4. Medien zu Kultivierung von Bakterien ............................................................................ 27 -- 3.1.5. Eukaryotische Zelllinien .................................................................................................. 28 -- 3.1.6. Bakterienstämme ............................................................................................................ 28 -- 3.1.7. Antibiotika ....................................................................................................................... 28 -- 3.1.8. Proteine und Standards .................................................................................................. 28 -- 3.1.9. Antikörper ....................................................................................................................... 29 -- 3.1.9.1. Primäre Antikörper .................................................................................................... 29 -- 3.1.9.2. Sekundäre Antikörper ............................................................................................... 30 -- 3.1.10. sonstige Detektionsreagenzien .................................................................................... 30 -- 3.1.11. Primersequenzen ......................................................................................................... 30 -- 3.1.12. Vektoren ....................................................................................................................... 31 -- 3.1.13. Enzyme ........................................................................................................................ 33 -- 3.1.14. Kits und Protokolle ....................................................................................................... 34 -- -- 3.1.15. Verbrauchsmaterialien ................................................................................................. -- 34 -- 3.1.16. Laborausstattung ......................................................................................................... 35 -- 3.1.17. Software ....................................................................................................................... 36 -- 3.2. Methoden ............................................................................................................................ 37 -- 3.2.1. Zellkultur ......................................................................................................................... 37 -- 3.2.1.1. Allgemeines ............................................................................................................... 37 -- 3.2.1.2. Kultivierung von HEK293- und HEK293/TCM-Zellen ............................................... 37 -- 3.2.1.3. Kultivierung von THP1-Zellen ................................................................................... 37 -- 3.2.1.4. Kryokonservierung von Zellen .................................................................................. 38 -- 3.2.1.5. Revitalisierung kryokonservierter Zellen ................................................................... 38 -- 3.2.1.6. Zellzahlbestimmung .................................................................................................. 38 -- 3.2.2. Arbeiten mit Escherichia coli (E. coli) ............................................................................. 38 -- 3.2.2.1. Kultivierung von E. coli .............................................................................................. 38 -- 3.2.2.2. Kryokonservierung von E. coli .................................................................................. 39 -- 3.2.2.3. Herstellung chemisch kompetenter E. coli ................................................................ 39 -- 3.2.2.4. Transformation chemisch kompetenter E. coli .......................................................... 39 -- 3.2.3. Molekularbiologische Methoden ..................................................................................... 40 -- 3.2.3.1. Präparation plasmidischer DNA ................................................................................ 40 -- 3.2.3.2. Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA ....................................................... 40 -- 3.2.3.3. Enzymatische Behandlung von DNA ........................................................................ 41 -- 3.2.3.3.1. Analytische und präparative Restriktion .............................................................. 41 -- 3.2.3.3.2. Ligation der mutierten S100A12-DNA in pEF-IRES ............................................ 41 -- 3.2.3.4. Gelelektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten .......................................... 42 -- 3.2.3.5. Nachweis der Genexpression ................................................................................... 43 -- 3.2.3.6. Site-directed Mutagenesis ........................................................................................ 44 -- 3.2.3.7. Sequenzierung .......................................................................................................... 45 -- 3.2.3.8. Stabile Transfektion von HEK293-Zellen .................................................................. 45 -- 3.2.4. Proteinbiochemische Methoden ..................................................................................... 46 -- 3.2.4.1. Rekombinante Expression von Proteinen in HEK293-Zellen ................................... 46 -- 3.2.4.2. Rekombinante Expression von Protein in E. coli BL21(DE3) ................................... 46 -- 3.2.4.3. Aufreinigung der in E. coli exprimierten Proteine ...................................................... 47 -- 3.2.4.3.1. Anionenaustauschchromatographie (AIEX) ........................................................ 47 -- 3.2.4.3.2. Kalzium-abhängige hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ................. 48 -- 3.2.4.4. Aufreinigung der in HEK293-Zellen exprimierten Proteine ....................................... 49 -- 3.2.4.4.1. Konzentrationsbestimmung von Proteinen ......................................................... 49 -- 3.2.4.5. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ........................................................ 50 -- 3.2.4.6. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ............................................................... 51 -- 3.2.4.6.1. Coomassie-Färbung ............................................................................................ 52 -- 3.2.4.7. Westernblot (WB) ...................................................................................................... 52 -- 3.2.4.8. Densitometrie ............................................................................................................ 53 -- -- 3.2.4.9. Stimulation von HEK293/TCM-Zellen ....................................................................... -- 53 -- 3.2.4.10. Stimulation von THP1-Zellen .................................................................................. 53 -- 3.2.4.11. Entfernung von LPS mittels EndoTrap ................................................................... 54 -- 3.2.4.12. Bestimmung der LPS-Konzentration mittels EndoLISA .......................................... 54 -- 3.2.4.13. Chemische Quervernetzung von Proteinen ............................................................ 55 -- 3.2.4.14. Größenfiltration der Proteine ................................................
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|a free access
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|a Das Kalzium-Bindeprotein S100A12 fungiert sowohl als Signalmolekül als auch als Biomarker bei verschiedenen (auto)inflammatorischen Erkrankungen. In Abwesenheit der Ionen Kalzium (Ca) und Zink (Zn) liegt es überwiegend als Dimer vor. Die Bindung von Ca und/oder Zn führt zu einer Konformationsänderung und damit zur Oligomerisierung. In dieser Arbeit wurden S100A12-Mutanten durch Substitution der an der Ca- oder Zn-Bindung beteiligten Aminosäuren (AS) erzeugt und auf ihre Komplexbildung sowie RAGE-/TLR-4-Bindung und -Aktivierung hin analysiert. Substitutionen der für die Zn-Bindung essentiellen AS haben weniger Einfluss auf die Komplexbildung als Mutationen der Ca-bindenden AS. Funktionelle Analysen der Mutanten zeigten, dass alle Komplexformen des S100A12 in der Lage sind, die Rezeptoren TLR-4 und RAGE zu binden. Bei Analysen zur Rezeptor-Aktivierung ist hingegen deutlich geworden, dass ausschließlich hexameres S100A12 in der Lage ist, eine Signaltransduktion über TLR 4 zu initiieren.
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|a specialized
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|a InC 1.0
|u https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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|a Kalzium-Bindeprotein
|a S100A12
|a Oligomerisierung
|a TLR-4
|a RAGE
|a Signaltransduktion
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7 |
|2 DRIVER Types
|a Dissertation/Habilitation
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7 |
|2 DCMI Types
|a Text
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|a Föll, Dirk
|u FB 13: Biologie
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|3 Zum Volltext
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