The impact of nitrogen deprivation on genome evolution in Escherichia coli

Bakterien nehmen Nährstoffe aus ihrer Umgebung auf und nutzen diese für die de novo Synthese von Aminosäuren, Nukleotiden und anderen Biomolekülen. Stickstoff, ein wesentlicher Bestandteil von Biomolekülen, ist oft ein limitierender Faktor für das Wachstum in Ökosystemen. Die vorliegende Studie zeig...

Parallel title:Die Auswirkungen von Stickstoffmangel auf die Genomevolution in Escherichia coli
Author: Henze, Stefanie
Further contributors: Acquisti, Claudia (Thesis advisor)
Division/Institute:FB 13: Biologie
Document types:Doctoral thesis
Media types:Text
Publication date:2016
Date of publication on miami:23.08.2016
Modification date:23.08.2016
Edition statement:[Electronic ed.]
Subjects:Stickstoff; Genomevolution; Stickstoffmangel; Stressantwort; Stoichiogenomics
DDC Subject:570: Biowissenschaften; Biologie
License:InC 1.0
Language:English
Format:PDF document
URN:urn:nbn:de:hbz:6-64299642331
Permalink:http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hbz:6-64299642331
Digital documents:diss_henze.pdf
Table of contents:
  • Contents
  • List of Figures V
  • List of Tables VII
  • List of Abbreviations VIII
  • Summary 1
  • Zusammenfassung 3
  • 1 Introduction 5
  • 1.1 The way of elements from the environment to biomolecules . . . . . . . 5
  • 1.1.1 How essential elements enter ecosystems . . . . . . . . . . . . . 5
  • 1.1.2 Maintenance of elemental composition . . . . . . . . . . . . . . 6
  • 1.1.3 Nitrogen and carbon assimilation in Escherichia coli . . . . . . 7
  • 1.2 The role of nutrient availability for genome evolution . . . . . . . . . . 10
  • 1.2.1 Why nutrient deprivation might shape the element composition
  • of macromolecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
  • 1.2.2 Evidence for element based monomer usage bias . . . . . . . . . 11
  • 1.3 Two Experiments - Two Timescales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
  • 1.3.1 Transient nutrient starvation of filter cultures . . . . . . . . . . 15
  • 1.3.2 Persistent nitrogen limitation in continuous culture . . . . . . . 17
  • 2 Material 18
  • 2.1 Devices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
  • 2.2 Consumables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
  • 2.3 Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
  • 2.4 Chemicals, enzymes and media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
  • 2.4.1 Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
  • 2.4.2 Enzymes and corresponding buffers . . . . . . . . . . . . . . . . 22
  • 2.4.3 Culture media and buffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
  • 2.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
  • 2.6 Databases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
  • 2.7 Oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
  • 2.8 Strains and plasmids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
  • 2.8.1 Escherichia coli Nissle 1917 delta fli C . . . . . . . . . . . . . . . . 28
  • 3 Methods 30
  • 3.1 Microbiological Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
  • 3.1.1 Storage and incubation of bacterial cultures . . . . . . . . . . . 30
  • 3.1.2 Determination of cell density and cell number . . . . . . . . . . 30
  • 3.1.3 Congored assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
  • 3.1.4 Motility assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
  • 3.2 Molecular biological Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
  • 3.2.1 Isolation of genomic DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
  • 3.2.2 Polymerase chain reaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
  • 3.2.2.1 E. coli Nissle 1917-specific multiplex PCR . . . . . . . 32
  • 3.2.2.2 Amplification of the kanR gene from pACY177 . . . . 33
  • 3.2.2.3 Amplification of the kanR gene from pUC-kanR . . . . 34
  • 3.2.3 Gel electrophoresis and DNA purification . . . . . . . . . . . . . 35
  • 3.2.4 Isolation of plasmid DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
  • 3.2.5 Restriction digest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
  • 3.2.6 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
  • 3.2.7 Ethanol precipitation of DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
  • 3.2.8 Concentration and purity of nucleic acids . . . . . . . . . . . . . 36
  • 3.2.9 Transformation of E. coli cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
  • 3.2.9.1 Preparation of electrocompetent cells . . . . . . . . . . 37
  • 3.2.9.2 Electroporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
  • 3.2.10 Insertion of the kanamycin resistance gene into the chromosome
  • of E. coli Nissle 1917 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
  • 3.3 Preparation of a defined culture medium . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
  • 3.3.1 Composition and preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
  • 3.3.2 Testing the full minimal medium . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
  • 3.3.3 Minimal media for the short-term starvation experiment . . . . 42
  • 3.3.4 Nitrogen limited medium for the long-term
  • continuous culture experiment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
  • 3.4 Transient nutrient starvation of filter cultures . . . . . . . . . . . . . . 46
  • 3.4.1 General overview of the experimental design . . . . . . . . . . . 46
  • 3.4.1.1 Filter loading with liquid culture . . . . . . . . . . . . 47
  • 3.4.1.2 Incubation on solid full minimal medium . . . . . . . . 49
  • 3.4.1.3 Starvation on deficient minimal medium . . . . . . . . 50
  • 3.4.2 Sampling scheme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
  • 3.5 Persistent nitrogen limitation in continuous culture . . . . . . . . . . . 53
  • 3.5.1 General overview of the experimental design . . . . . . . . . . . 53
  • 3.5.1.1 Dilution rate, generation time and ammonium availability 56
  • 3.5.1.2 Construction and Cleaning . . . . . . . . . . . . . . . 59
  • 3.5.1.3 Housekeeping and backups . . . . . . . . . . . . . . . . 60
  • 3.5.2 Sampling scheme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
  • 3.6 Chromatographic analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
  • 3.6.1 Detection of free cellular metabolites of filter cultures . . . . . . 63
  • 3.6.2 Determination of the carbon to nitrogen ratio of continuous cultures 64
  • 3.6.3 Detection of cations in the effluent of continuous cultures . . . . 64
  • 3.7 Transcriptomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
  • 3.7.1 Cell harvest for RNA isolation from filter cultures . . . . . . . . 65
  • 3.7.2 Cell harvest for RNA isolation from continuous cultures . . . . . 65
  • 3.7.3 RNA isolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
  • 3.7.4 RNA quality . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
  • 3.7.5 cDNA library preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
  • 3.7.6 RNA sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
  • 3.8 Bioinformatics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
  • 3.8.1 Annotation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
  • 3.8.2 Assesesment of differential levels of expression . . . . . . . . . . 70
  • 3.8.3 Mapping to metabolic pathways . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
  • 3.9 Statistics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
  • 4 Results 73
  • 4.1 Transient nutrient starvation of filter cultures . . . . . . . . . . . . . . 73
  • 4.1.1 Basic cellular starvation-survival response . . . . . . . . . . . . 73
  • 4.1.1.1 Ribosomal gene expression . . . . . . . . . . . . . . . . 74
  • 4.1.1.2 Dynamics of nutrient key metabolites . . . . . . . . . . 77
  • 4.1.1.3 Expression of genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
  • 4.1.2 Intracellular mobilization of deprived nutrients . . . . . . . . . . 89
  • 4.1.2.1 Mobilization of nitrogen rich amino acids during nitrogen
  • starvation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
  • 4.1.2.2 Mobilization of lipids during carbon starvation . . . . 94
  • 4.1.2.3 Mobilization of carbohydrates during carbon starvation 100
  • 4.1.2.4 Mobilization of amino acids during carbon starvation . 102
  • 4.1.3 Nitrogen conservation in proteins and utilization of internal nitrogen
  • reserves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
  • 4.1.3.1 Protein nitrogen content . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
  • 4.1.3.2 Nitrogen rich amino acids: avoided in proteins and utilized
  • as nitrogen source . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
  • 4.2 Persistent nitrogen limitation in continuous culture . . . . . . . . . . . 114
  • 4.2.1 Basic cellular response to nitrogen limitation . . . . . . . . . . . 114
  • 4.2.1.1 Expression of key genes . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
  • 4.2.1.2 Enhancement of ammonium uptake . . . . . . . . . . . 116
  • 4.2.1.3 Morphological changes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
  • 4.2.2 Signals of nitrogen conservation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
  • 4.2.2.1 Cellular carbon and nitrogen content . . . . . . . . . . 121
  • 4.2.2.2 Protein nitrogen content . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
  • 4.2.3 Did adaptation to prolonged nitrogen limitation lead to growth
  • advantages? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
  • 4.2.3.1 Fitness during comparative growth of evolved continuous
  • cultures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
  • 4.2.3.2 Fitness during competitive growth of evolved continuous
  • cultures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
  • 5 Discussion 143
  • 5.1 Transient nutrient starvation of filter cultures . . . . . . . . . . . . . . 143
  • 5.1.1 Basic cellular starvation-survival response . . . . . . . . . . . . 145
  • 5.1.1.1 Decrease of protein synthesis . . . . . . . . . . . . . . 145
  • 5.1.1.2 Metabolic cascades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
  • 5.1.1.3 Improved nutrient scavenging . . . . . . . . . . . . . . 148
  • 5.1.2 Intracellular mobilization of deprived nutrients . . . . . . . . . . 150
  • 5.1.2.1 Mobilization of carbon and energy reserves during carbon
  • starvation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
  • 5.1.2.2 Mobilization of nitrogen reserves during nitrogen starvation
  • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
  • 5.1.3 Nitrogen conservation in proteins is linked to a biased free amino
  • acid pool . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
  • 5.2 Persistent nitrogen limitation in continuous culture . . . . . . . . . . . 159
  • 5.2.1 Basic cellular response to nitrogen limitation . . . . . . . . . . . 161
  • 5.2.1.1 Improved nitrogen acquisition . . . . . . . . . . . . . . 161
  • 5.2.1.2 Enhancement of ammonium uptake . . . . . . . . . . . 161
  • 5.2.1.3 Morphological changes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
  • 5.2.2 Signals of nitrogen conservation . . . . . . . . . . . . . .