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Beeinflussung von Osteoblasten und Endothelzellen durch Zoledronat in vitro

Zielsetzung: Um Hinweise zur Pathogenese der Bisphosphonat-assoziierten Osteonekrose im Kiefer (BP-ONJ) zu sammeln, wurden bovine Osteoblasten-ähnliche Zellen (OBs) und Endothelzellen aus humaner Vena umbilica (HUVECs) in vitro untersucht. Methode: OBs und HUVECs wurden über 14 Tage bei 0,01, 0,1, 1 und 10 µM Zometa® (Zoledronsäure) kultiviert. An 6 Zeitpunkten wurden Stoffwechselaktivität (MTT-Assay) und Proliferationsrate (Cell-Count auf Fotos) ermittelt. Immunhistologische Färbungen zeigten die Expression von zellspezifischen Proteinen und ermöglichten die Dokumentation von Morphologieveränderungen. Ergebnisse: Für die OBs war ein positiver Proliferationseffekt festzustellen. Für die HUVECs ließ sich kein verändertes Verhalten nachweisen. Diskussion: Zoledronsäure führt zu einer gesteigerten Proliferation von OBs. Zusammen mit den bereits bekannten antiangiogenetischen und Osteoklastenresorptionsinhibierenden Wirkungen könnte dies mit zur Pathogenese einer BP-ONJ beitragen.

Titel: Beeinflussung von Osteoblasten und Endothelzellen durch Zoledronat in vitro
Verfasser: Beckmann, Eva GND
Gutachter: Kleinheinz, Johannes
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2014
Publikation in MIAMI: 29.08.2014
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: Zoledronat; Osteoblasten; Endothelzellen; Bisphosphonat-assoziierte Osteonekrose im Kiefer; Bisphosphonate; in vitro
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-32329406184
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-32329406184
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Inhalt:
Inhalt
I. Einleitung ........................................................................ 1
I.1. Bisphosphonate .......................................................... 1
I.1.1. Indikation .................................................................... 1
I.1.2. Kontraindikation ........................................................... 1
I.1.3. Historie ....................................................................... 2
I.1.4. Verschreibungszahlen .................................................... 2
I.1.5. Synthese und chemischer Aufbau ................................... 3
I.1.6. Klassifikation in Generationen ........................................ 4
I.1.7. Pharmakokinetik ........................................................... 5
I.1.8. Wirkungsweise ............................................................. 6
I.1.8.a. molekulare Ebene ........................................................... 6
I.1.8.b. zelluläre Ebene .............................................................. 11
I.1.8.c. gewebliche Ebene ........................................................... 12
I.1.9. Nebenwirkungen ......................................................... 13
I.1.10. Wechselwirkungen .................................................... 14
I.2. Bisphosphonat-assoziierte Kiefernekrose ..................... 15
I.2.1. Historie ..................................................................... 15
I.2.2. Begriff ....................................................................... 15
I.2.3. Definition ................................................................... 16
I.2.4. Klinik ........................................................................ 16
I.2.5. Differenzialdiagnosen .................................................. 17
I.2.6. Staging ..................................................................... 17
I.2.7. Risikofaktoren ............................................................ 18
I.2.8. Komplikationen .......................................................... 19
I.2.9. Inzidenz und Prävalenz ................................................ 19
I.2.10. Therapie .................................................................. 20
I.2.11. Ätiologie und Pathogenese ......................................... 22
I.3. Osteoblasten und Knochenumbau ............................... 26
I.4. Endothelzellen und Angiogenese ................................. 29
I.5. Zielsetzung .............................................................. 31
II. Material und Methoden ............................................ 32
II.1. Material .................................................................. 32
II.1.1. Material für die Zellkultur ........................................... 32
II.1.1.a. Zellen .......................................................................... 32
II.1.1.b. Nährmedien ................................................................. 32
II.1.1.c. Reagenzien und Lösungen .............................................. 33
II.1.2. Material für die Untersuchungsmethoden ...................... 36
II.1.2.a. MTT-Assay ................................................................... 36
II.1.2.b. Cell-Count ................................................................... 36
II.1.2.c. Färbungen.................................................................... 36
II.1.3. Medikament .............................................................. 38
II.1.4. Geräte und Verbrauchsmaterialien ............................... 39
II.2. Methoden ............................................................... 41
II.2.1. Gewinnung der Zellen ................................................ 41
II.2.1.a. Gewinnung der Osteoblasten .......................................... 41
II.2.1.b. Gewinnung der Endothelzellen ........................................ 43
II.2.2. Festlegen der Medikamentenkonzentrationen ................ 46
II.2.3. Untersuchungsmethoden ............................................ 48
II.2.3.a. MTT-Assay ................................................................... 48
II.2.3.b. Cell-Count ................................................................... 51
II.2.3.c. Färbungen.................................................................... 52
II.2.3.c.1. Immunfärbung mit Alexa-Fluor® ................................ 54
II.2.3.c.2. Immunfärbung mit Dako EnVision® ............................ 55
II.2.3.c.3. Richardsonfärbung ................................................... 57
II.2.4. Statistische Methoden zur Auswertung ......................... 58
III. Ergebnisse ............................................................. 59
III.1. Ergebnisse der Fotodokumentation ........................... 59
III.1.1. Fotodokumentation der Osteoblasten .......................... 59
III.1.2. Fotodokumentation der Endothelzellen ........................ 63
III.2. Ergebnisse der MTT-Assays ..................................... 67
III.2.1. MTT-Assay der Osteoblasten ...................................... 67
III.2.2. MTT-Assay der Endothelzellen .................................... 71
III.3. Ergebnisse der Cell-Counts ...................................... 75
III.3.1. Cell-Count der Osteoblasten ...................................... 75
III.3.2. Cell-Count der Endothelzellen .................................... 79
III.4. Ergebnisse der Färbungen ....................................... 82
III.4.1. Ergebnisse der Alexa-Fluor®-Immunfärbung ................ 82
III.4.1.a. Alexa-Fluor®-Färbung der Osteoblasten .......................... 82
III.4.1.b. Alexa-Fluor®-Färbung der Endothelzellen ........................ 83
III.4.2. Ergebnisse der Dako EnVision®-Immunfärbung ............ 84
III.4.2.a. Dako EnVision®-Färbung der Osteoblasten ...................... 84
III.4.2.b. Dako EnVision®-Färbung der Endothelzellen .................... 86
III.4.3. Ergebnisse der Richardsonfärbung .............................. 88
III.4.3.a. Richardsonfärbung der Osteoblasten .............................. 88
III.4.3.b. Richardsonfärbung der Endothelzellen ............................ 89
IV. Diskussion .............................................................. 90
IV.1. Einordnung der Ergebnisse ....................................... 90
IV.2. Studienlage ............................................................ 91
IV.2.1. Effekte auf Proliferationsrate und Stoffwechselaktivität .. 92
IV.2.1.a. Proliferation und Stoffwechselaktivität der Osteoblasten .... 92
IV.2.1.b. Proliferation und Stoffwechselaktivität der Endothelzellen . 94
IV.2.2. Effekte auf Morphologie und Gestalt der Zellen ............. 97
IV.2.2.a. Morphologie und Gestalt der Osteoblasten ....................... 97
IV.2.2.b. Morphologie und Gestalt der Endothelzellen .................... 97
IV.2.3. Effekte auf die Expression und Synthese von Proteinen . 99
IV.3. Fehleranalyse der Vorgehensweise .......................... 101
IV.3.1. Isolierung und Kultivierung der Zellen ....................... 101
IV.3.1.a. Isolierung und Kultivierung der Osteoblasten ................. 101
IV.3.1.b. Isolierung und Kultivierung der Endothelzellen ............... 101
IV.3.2. Versuchsdauer ........................................................ 103
IV.3.3. Verwendete Medikamentenkonzentration ................... 105
IV.3.3.a. Medikamentenkonzentration in den Osteoblastenkulturen 105
IV.3.3.b. Medikamentenkonzentration in den Endothelzellkulturen . 107
IV.3.4. Auswahl der Untersuchungsmethoden ....................... 109
IV.4. Erklärung der Ergebnisse ....................................... 111
IV.5. Schlussfolgerung .................................................. 113
IV.6. Ausblick und weitere Versuchsansätze ..................... 115
Literaturverzeichnis ................................................... 117
Abkürzungsverzeichnis .............................................. 133
Abbildungsverzeichnis ................................................ 136
Tabellenverzeichnis .................................................... 137
Lebenslauf .................................................................. 138
Danksagung ............................................................... 139
Anhang ............................................................................ I
I. Messdaten .................................................................... I
I.1. Analysedaten der MTT-Assays ........................................... I
I.1.1. Daten der Osteoblasten ....................................................... I
I.1.2. Daten der Endothelzellen ................................................... III
I.2. Analysedaten der Cell-Counts ........................................... V
I.2.1. Daten der Osteoblasten ...................................................... V
I.2.2. Daten der Endothelzellen .................................................. VII
II. Ethikvotum ................................................................ IX