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Molekulare Charakterisierung des Staphylococcus aureus-Oberflächenproteins SasC und Rolle in der Zell-Zell-Interaktion

In der vorliegenden Arbeit wurde das vormals uncharakterisierte Oberflächenprotein SasC von Staphylococcus aureus auf seine Funktion hin untersucht. Zunächst zeigte sich eine hohe Prävalenz des entsprechenden Gens sasC im Genom von 66 S. aureus- Stämmen. Nach Klonierung des sasC-Gens in den Expressionsvektor pCX19 und Transformation in den apathogenen Stamm S. carnosus TM300 konnte erstmals die Funktion des SasC als Zell-Zell-Adhäsion vermittelndes Protein bestimmt werden. Nach Expression des Proteins an der Oberfläche von S. carnosus zeigten bei Wachstum in der planktonischen Phase makroskopisch und mikroskopisch sichtbare Zellaggregate, die konzentrationsabhängig durch die Serinproteinase Trypsin aufgelöst werden konnten. Auch zeigten die Bakterien aufgrund ihrer Expression des SasC- Proteins eine verstärkte Biofilmbildung auf Polystyroloberflächen, was am ehesten auf die Vermittlung von interzellulärer Adhäsion durch das Protein zurückzuführen ist. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass das Protein SasC eine mögliche Rolle in der proteinvermittelten Biofilmakkumulation hat und einen wichtigen Pathogenitätsfaktor in der Pathogenese der klinisch schwierig zu beherrschenden Biofilm-assoziierten Infektionen von Staphylococcus aureus darstellen könnte.

Titel: Molekulare Charakterisierung des Staphylococcus aureus-Oberflächenproteins SasC und Rolle in der Zell-Zell-Interaktion
Verfasser: Jularic, Mario GND
Gutachter: Heilmann, Christine GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2016
Publikation in MIAMI: 23.05.2016
Datum der letzten Änderung: 23.05.2016
Schlagwörter: Staphylococcus aureus; Biofilm; interzelluläre Adhäsion; molekulare Charakterisierung; Oberflächenprotein
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-85289647520
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-85289647520
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Inhalt:
1 Einleitung ...................................................................................... 1
1.1 Das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus ............. 1
1.2 S. aureus-Infektonen ...................................................................... 2
1.3 Pathogenese von S. aureus-Infektionen ........................................ 3
1.4 Biofilme ........................................................................................... 7
1.4.1 Struktureller Aufbau des Biofilms .................................................... 10
1.4.2 Mechanismus der Biofilmbildung .................................................... 11
1.4.3 Initiale Adhärenz ............................................................................. 12
1.4.4 Akkumulative Phase ....................................................................... 12
1.4.5 Dispersion ....................................................................................... 15
1.5 Biofilm-assoziierte S. aureus-Infektionen ..................................... 16
1.5.1 Mechanismen der Antibiotikaresistenz in Biofilmen .......................... 2
1.5.2 Immunevasion .................................................................................. 3
1.6 Sortase und LPXTG-Motif .............................................................. 6
1.7 SasC ............................................................................................... 7
1.8 Fragestellung .................................................................................. 7
2 Material und Methoden ................................................................. 9
2.1 Material ........................................................................................... 9
2.1.1 Bakterienstämme .............................................................................. 9
2.1.2 Primer ............................................................................................. 10
2.1.3 Enzyme ........................................................................................... 10
2.1.4 Antibiotika ....................................................................................... 11

2.1.5 Chemikalien .................................................................................... 11
2.1.6 Laborgeräte .................................................................................... 12
2.1.7 Kits .................................................................................................. 14
2.2 Methoden ...................................................................................... 15
2.2.1 Anzucht und Stammhaltung der Bakterien ..................................... 15
2.2.2 Isolierung chromosomaler DNA ...................................................... 16
2.2.3 DNA-Konzentrationsbestimmung ................................................... 17
2.2.4 Agarose-Gelelektrophorese ............................................................ 17
2.2.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................. 19
2.2.6 Reinigung der PCR-Produkte ......................................................... 21
2.2.7 Genexpression in S. carnosus (pSasC4074) .................................. 21
2.2.8 Isolierung von Oberflächen-assoziierten Proteinen ........................ 21
2.2.9 Proteinauftrennung durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) .............................................................................................. 22
2.2.10 Phasenkontrastmikroskopische Darstellung der Zellaggregation . 26
2.2.11 Trypsin-Desaggregationsassay .................................................... 26
2.2.12 Biofilmassay .................................................................................. 27
2.2.13 Bioinformatische Strukturanalyse ................................................. 28
3 Ergebnisse .................................................................................. 29
3.1 Prävalenz des sasC-Gens bei klinischen S. aureus-Isolaten ....... 29
3.2 Expression des sasC-Gens in S. carnosus (pSasC4074) ............ 31
3.3 SasC vermittelt starke Zellaggregation in S. carnosus ................. 32
3.4 SasC-vermittelte Zellaggregation ist Protease-sensitiv ................ 35

3.5 Biofilmbildung auf Polystyrol ......................................................... 37
3.6 Bioinformatische Strukturanalyse des SasC-Protein .................... 38
3.6.1 Analyse der SasC-Aminosäuresequenz ......................................... 38
3.6.2 COILS - Prediction of Coiled Coil Regions in Proteins ................... 39
4 Diskussion .................................................................................. 41
4.1 Epidemiologie des sasC-Gens ..................................................... 41
4.2 SasC-vermittelte Zellaggregation ................................................. 41
4.3 Mechanismus der Zell-Zell-Interaktion ......................................... 42
4.4 Bedeutung von SasC in der Biofilmentstehung ............................ 45
4.5 Expression des sasC-Gens in S. aureus Wildtypstämmen .......... 47
4.6 Regulation des sasC-Gens ........................................................... 48
4.7 Zusammenfassung und Ausblick .................................................. 52
5 Literaturverzeichnis ..................................................................... 56
6 Abbildungsverzeichnis ................................................................ 76
6.1 Abbildungsverzeichnis .................................................................. 76
6.2 Tabellenverzeichnis ...................................................................... 76
7 Anhang .......................................................................................... I
7.1 Abkürzungen und Maßeinheiten ...................................................... I
7.2 Tabellen ........................................................................................ IV
7.3 Publikation ................................................................................... VII
7.4 Lebenslauf .................................................................................. VIII
7.5 Danksagung .................................................................................. X