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Die Bedeutung der Proteoglykane Syndecan-1 und Syndecan-4 während der Frakturheilung

Die Frakturheilung stellt einen hochkomplexen Reparaturmechanismus dar, der Prozesse der Embryogenese im entzuendlichen Kontext rekapituliert. Die beiden Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) Syndecan-1 und Syndecan-4 sind an zahlreichen Heilungs- und Reparaturvorgaengen beteiligt. In der vorliegenden Arbeit konnte eine funktionelle Relevanz fuer die beiden Proteoglykane in der Frakturheilung gezeigt werden. Syndecan-1- bzw. Syndecan-4-defiziente Maeuse wiesen eine verzoegerte Frakturheilung auf. Des Weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit eine spezifische Hochregulation der Expression von Syndecan-1 und Syndecan-4 in unterschiedlichen Zelltypen des Knochengewebes gezeigt werden. Die Expression der beiden HPSG unterlag der Kontrolle von Zytokinen, die waehrend der Frakturheilung wichtige Prozesse regulieren. In der Vermittlung von inflammatorischen Signalen ueben Syndecane eine funktionelle Rolle aus, jedoch wirkt jedes Syndecan-Protein in seiner speziellen Zell- und Gewebenische.

Titel: Die Bedeutung der Proteoglykane Syndecan-1 und Syndecan-4 während der Frakturheilung
Verfasser: Hidding, Heriburg GND
Gutachter: Raschke, Michael J.
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 11.11.2013
Publikation in MIAMI: 11.11.2013
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: Frakturheilung; Knochenstoffwechsel; Syndecan-1; Syndecan-4; Proteoglykan; enchondrale Ossifikation
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-55319555103
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-55319555103
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Inhalt:
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... V
TABELLENVERZEICHNIS ......................................................................................................... VII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................... VIII
1 EINLEITUNG ...................................................................................................................... 1
1.1 Frakturheilung ........................................................................................................... 1
1.1.1 Phasen der Frakturheilung ................................................................................. 1
1.1.2 Degradation der Knorpelmatrix .......................................................................... 9
1.2 Syndecan - ein integrales Heparansulfat-Proteoglykan ........................................... 12
1.2.1 Proteinstruktur der Syndecane ........................................................................ 14
1.2.2 Syndecan als Co-Rezeptor und als eigenständiger Rezeptor .......................... 15
1.2.3 Syndecan als Adhäsionsrezeptor ..................................................................... 15
1.2.4 Syndecan vermittelte Endozytose .................................................................... 16
1.2.5 Shedding der Ectodomäne .............................................................................. 17
1.2.6 Syndecan-1 ..................................................................................................... 17
1.2.7 Syndecan-4 ..................................................................................................... 19
2 ZIEL DER ARBEIT ............................................................................................................. 22
3 MATERIAL UND METHODEN .............................................................................................. 23
3.1 Materialien .............................................................................................................. 23
3.1.1 Reagenzien und Lösungen .............................................................................. 23
3.1.2 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................... 23
3.1.3 Geräte ............................................................................................................. 23
3.1.4 Computer Software .......................................................................................... 25
3.1.5 Puffer, Lösungen und Nährmedien .................................................................. 25
3.1.6 Primer .............................................................................................................. 28
3.1.7 Antikörper ........................................................................................................ 29
3.2 Tiere ....................................................................................................................... 30
3.3 Experimentelle Tierversuche .................................................................................. 31
3.3.1 Versuchstiergruppen ........................................................................................ 31
3.3.2 Eingriffe und Behandlungen an den Tieren ...................................................... 32
3.4 Zellbiologische Methoden ....................................................................................... 34
3.4.1 Zellkultur .......................................................................................................... 34
3.4.2 Isolierung Osteoprogenitor-Zellen aus neonatalen Calvarien ........................... 34
3.4.3 Isolierung von Knochenmarkzellen und Differenzierung zu Osteoklasten ........ 35
3.4.4 Isolation mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark....................... 36
3.4.5 Osteogene Differenzierung .............................................................................. 36
3.4.6 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 37
3.4.7 Adipogene Differenzierung .............................................................................. 37
3.4.8 Stimulationsversuche mit TNFα und IL-1β ....................................................... 37
3.4.9 Kryokonservierung und Rekultivierung der MSZ .............................................. 38
3.5 Proteinbiochemische Methoden .............................................................................. 38
3.5.1 Bestimmung der Proliferation ........................................................................... 38
3.5.2 Nachweis der Alkalische Phosphatase Aktivität ............................................... 39
3.6 Molekularbiologische Methoden .............................................................................. 39
3.6.1 RNA-Isolation .................................................................................................. 39
3.6.2 Synthese der cDNA ......................................................................................... 40
3.6.3 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion .......................................................... 40
3.6.4 Genotypisierung der knock out Tiere ............................................................... 41
3.6.5 Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten .......................................... 42
3.7 Aufbereitung der histologischen Präparate ............................................................. 42
3.7.1 Herstellung von Paraffin-Schnittpräparaten ..................................................... 43
3.7.2 Herstellung von Kunstharz-Schnittpräparaten .................................................. 44
3.8 Histochemische Methoden ...................................................................................... 45
3.8.1 Nachweis von Adipozyten mittels Oil Red O-Färbung ...................................... 45
3.8.2 Von Kossa Färbung zur Visualisierung des mineralisierten Gewebes bzw. der extrazellulären Matrix ..................................................................................................... 45
3.8.3 Alizarinrot-S-Färbung zur Quantifizierung der Kalzifizierung der extrazellulären Matrix ........................................................................................................................ 46
3.8.4 Identifikation von Knorpelgewebe mittels Alcianblau Färbung .......................... 46
3.8.5 Identifikation von Knochengewebe mittels Masson-Goldner Färbung .............. 47
3.8.6 Nachweis von Osteoklasten mittels TRAP Färbung ......................................... 47
3.8.7 Alcianblau-Kernechtrot-Färbung des gesamten murinen Skeletts .................... 48
3.9 Immunhistologische Methoden ............................................................................... 49
3.9.1 Detektion von Kollagen II und X mittels Dako ARKTM ....................................... 49
3.9.2 MMP-9 und TRAP -Doppelfärbung .................................................................. 50
3.9.3 MMP-13- und ADAMTS-4-Immunhistologie ..................................................... 50
3.9.4 Immunhistologischer Nachweis proliferierender Chondrozyten ........................ 51
3.10 Quantitative Auswertung der histologischen Präparate ........................................... 51
3.11 Biomechanische Testungen .................................................................................... 52
3.12 μCT-Analysen ......................................................................................................... 55
3.13 Datenanalyse .......................................................................................................... 56
4 ERGEBNISSE ................................................................................................................... 57
4.1 Frakturheilung ......................................................................................................... 57
4.1.1 Charakterisierung des Frakturkallus am 14. postoperativen Tag ..................... 57
4.1.2 Lokalisation der Proteasen im Frakturkallus .................................................... 60
4.1.3 Charakterisierung des Frakturkallus 28 Tage nach einer Fraktur ..................... 64
4.2 Syndecan-1 im Knochenstoffwechsel ..................................................................... 65
4.2.1 Expression und Funktionalität von Syndecan-1 während der Osteoklasten-Differenzierung in vitro ................................................................................................... 66
4.2.2 Expression und Funktionalität von Syndecan-1 während der Osteoblasten-Differenzierung .............................................................................................................. 72
4.2.3 Knochenphänotyp der adulten Syndecan-1-defizienten Maus ......................... 74
4.2.4 Knochenphänotyp der neonatalen Syndecan-1-defizienten Maus.................... 79
4.3 Die Rolle von Syndecan-4 während der frühen Phase der Frakturheilung .............. 81
4.3.1 Expression von Syndecan-4 in mesenchymalen Stammzellen ........................ 82
4.3.2 Auswirkung der Reduktion der TNFα-Konzentration auf das Fehlen von Syndecan-4 während der Frakturheilung ....................................................................... 84
5 DISKUSSION .................................................................................................................... 89
5.1 Verzögerte Frakturheilung in der Syndecan-1 und Syndecan-4-defizienten Maus .. 89
5.1.1 Der Verlust von Syndecan-1 und Syndecan-4 resultiert in einer verzögerten Frakturheilung ................................................................................................................ 89
5.1.2 Einfluss von Syndecan-1 und Syndecan-4 auf die Differenzierung von
Chondrozyten ................................................................................................................ 90
5.1.3 Einfluss von Syndecan1 und Syndecan-4 auf die Degradation der Knorpelmatrix ........................................................................................................................ 90
5.2 Syndecan-4 in der Frakturheilung ........................................................................... 92
5.2.1 TNFα und IL-1β modulieren die Expression von Syndecan-4 .......................... 92
5.2.2 Syndecan-4 beeinflusst die Proliferation von Chondrozyten ............................ 93
5.2.3 TNFα beeinflusst die Frakturheilung in einem Syndecan-4 abhängigen Mechanismus ................................................................................................................ 95
5.2.4 Funktionelle Bedeutung von Syndecan-4 während der Frakturheilung ............ 97
5.3 Die Rolle von Syndecan-1 im Knochenstoffwechsel ............................................... 98
5.3.1 Reduzierte Anzahl an Osteoklasten innerhalb des Frakturkallus der Syndecan-1-defizienten Maus ........................................................................................................ 98
5.3.2 RANKL und TNFα regulieren die Syndecan-1-Expression in Osteoklasten Vorläuferzellen ............................................................................................................... 99
5.3.3 Syndecan-1 beeinflusst die Osteoklastogenese in vitro ................................. 100
5.3.4 Erhöhte Osteoklastenaktivität in der adulten Syndecan-1-defizienten Maus .. 101
5.3.5 Das Fehlen von Syndecan-1 führt zur Ausbildung unterschiedlicher .............. 103
Phänotypen ................................................................................................................. 103
ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 107
LITERATUR........................................................................................................................... 109