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Vorkommen und Transkription des ToxB-Gens in enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) O157

EHEC besitzen eine Vielzahl von genetisch unterschiedlich lokalisierten Pathogenitätsfaktoren. Auf dem Plasmid pO157, welches nahezu in allen EHEC O157:H7 vorhanden ist, befindet sich ein Gen, welches für ToxB kodiert. ToxB ist für eine gesteigerte Erregeradhärenz verantwortlich. In dieser Arbeit wurde toxB mittels PCR in allen EHEC O157:H7 (n=18), nicht aber in Sorbitol-fermentierenden (SF) O157:H- (n=17) nachgewiesen. Anschließend wurde durch eine Schmelzkurvenanalyse die charakteristische Schmelztemperatur von 74,3°C für toxB PCR-Produkte ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass die Transkription von toxB temperatur- und pH-Wert-abhängig ist. Die höchste Expression erfolgte bei einem pH-Wert von 8,3 und einer Temperatur von 37°C. Im Vergleich hierzu war die mRNA-Expression des toxB im sauren Milieu bei 30°C erniedrigt. Ob die gesteigerte Transkription des toxB auch zu einer gesteigerten Adhärenz führt, muss untersucht werden.

Titel: Vorkommen und Transkription des ToxB-Gens in enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) O157
Verfasser: Rassi Warai, Gregor GND
Gutachter: Karch, Helge GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 03.02.2014
Publikation in MIAMI: 03.02.2014
Datum der letzten Änderung: 03.02.2014
Schlagwörter: toxB; EHEC; O157:H7; Transkription; mRNA-Expression
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-04339571635
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-04339571635
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Inhalt:
ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................... I
INHALTSVERZEICHNIS ................................................................................... III
1 EINLEITUNG ........................................................................................... 1
1.1 Einleitung zu EHEC ................................................................................. 1
1.2 Klinik ........................................................................................................ 3
1.3 Therapie ................................................................................................... 3
1.4 Pathophysiologie ..................................................................................... 4
1.5 toxB im Plasmid pO157 ........................................................................... 5
2 ZIELSETZUNG ........................................................................................ 6
3 MATERIAL UND METHODEN ................................................................ 7
3.1 Material .................................................................................................... 7
3.1.1 Herkunft der verwendeten E. coli-Stämme 7
3.1.2 Geräte 7
3.1.3 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien 8
3.2 Methoden ............................................................................................... 10
3.2.1 Nachweis des toxB mittels PCR 10
3.2.2 Agarose-Gelelektrophorese 11
3.2.3 Verfahren zur RNA-Gewinnung 11
3.2.4 Optimierung der Primerkonzentration und der Templatemenge 16
3.2.5 One-Step Real-Time RT-PCR zur quantitativen Ermittlung der toxB-Transkription
3.2.6 One-Step Real-time RT-PCR Datenanalyse 20
4 ERGEBNISSE ....................................................................................... 22
4.1 PCR Nachweis von toxB in Stx-produzierenden E. coli O157:H7 und SF O157:H- ................................................................................................. 22
4.2 Kontrolle der RNA-Proben auf DNA-Kontamination mittels Real-Time PCR ....................................................................................................... 23
4.3 Schmelzkurvenanalyse .......................................................................... 24
4.4 Optimierung der Primerkonzentration und der Templatemenge ............ 25
4.5 One-Step Real-Time RT-PCR zur quantitativen Ermittlung der mRNA-Expression von toxB bei verschiedenen pH-Werten und konstanter Temperatur von 22°C bei EDL933 ......................................................... 26
4.6 One-Step Real-Time RT-PCR zur quantitativen Ermittlung der mRNA-Expression von toxB bei verschiedenen pH-Werten und konstanter Temperatur von 30°C bei EDL933 ......................................................... 28
4.7 One-Step Real-Time RT-PCR zur quantitativen Ermittlung der mRNA-Expression von toxB bei verschiedenen pH-Werten und konstanter Temperatur von 37°C bei EDL933 ......................................................... 30
5 DISKUSSION ........................................................................................ 32
6 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................. 36
7 ANHANG ............................................................................................... 42
7.1 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................... 42
7.2 Abbildungsverzeichnis ........................................................................... 43
7.3 Tabellenverzeichnis ............................................................................... 44