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Effektivität einer Kombination von Telomerasehemmung und Chemotherapie beim Ewing Sarkom

Telomerase ist in über 85% aller Tumorzellen nachweisbar und befähigt u.a. zur Überwindung zellulärer Seneszenz. Ihre Hemmung erscheint, insbesondere in Kombination mit Chemotherapie, als sinnvoller Ansatz potentieller Anti-Tumor-Strategien. Durch Expression eines dominant-negativen hTERT-Gens (DNhTERT) in der Ewing Sarkom (ES)-Zelllinie STA-ET1 und RM-82 wurde eine effektive Telomerenverkürzung und Reduktion der Telomeraseaktivität (TA) erreicht, welche sich bei STA-ET1 zudem im Proliferationsverlust äußerte. Bei STA-ET1 zeigte sich mit zunehmender Passage eine Reaktivierung von TA ohne Einfluss auf Telomerenlänge und Proliferation. DNhTERT bewirkte bei beiden ES-Zelllinien eine Sensibilisierung gegenüber Doxorubicin und ergab Hinweise auf eine Sensibilisierung gegenüber Ifosfamid. Für Etoposid zeigten sich für beide Zelllinien divergente Ergebnisse (Sensibilisierung und Resistenzerhöhung). Hinweise auf eine tendenzielle Resistenzerhöhung konnten gegenüber Vincristin gesehen werden.

Titel: Effektivität einer Kombination von Telomerasehemmung und Chemotherapie beim Ewing Sarkom
Verfasser: Maatz, Annika GND
Gutachter: Boos, Joachim GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2019
Publikation in MIAMI: 17.09.2019
Datum der letzten Änderung: 17.09.2019
Schlagwörter: Ewing Sarkom; Telomerase; Telomerasehemmung; Chemotherapie; Telomeraseaktivität; Telomerenlänge; DNhTERT
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Lizenz: CC BY-SA 4.0
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-43179736006
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-43179736006
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Inhalt:
I. INHALT ...............................................................................................................I
II. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .....................................................................III
1. EINLEITUNG ..................................................................................................... 1
1.1 TELOMERASE UND TELOMERE ...................................................................... 1
1.1.1 Die Telomere – Wirkort der Telomerase ................................................ 1
1.1.2 Struktur und Funktion der Telomerase ................................................... 5
1.1.3 Vorkommen der Telomerase in humanen Zellen ..................................... 7
1.1.4 Regulation der Telomeraseaktivität ........................................................ 8
1.1.5 Stellenwert der Telomerase in Tumoren und immortalen Zellen ........... 10
1.1.6 Alternative Verlängerung der Telomeren (ALT- Mechanismus) ............ 12
1.1.7 Telomerase-Inhibitoren ........................................................................ 15
1.1.8 Telomerasehemmung und Chemotherapie ............................................ 21
1.2 DAS EWING SARKOM .................................................................................. 25
1.2.1 Epidemiologie ...................................................................................... 25
1.2.2 Ätiologie und Lokalisation ................................................................... 26
1.2.3 Tumorbiologie und Zytogenetik ............................................................ 27
1.2.4 Telomeraseaktivität beim Ewing Sarkom .............................................. 28
1.2.5 Klinik ................................................................................................... 30
1.2.6 Diagnostik und Stadieneinteilung ......................................................... 31
1.3 THERAPIEOPTIONEN BEIM EWING SARKOM ............................................... 31
1.3.1 Chemotherapie .................................................................................... 33
1.3.2 Lokaltherapie (Operative-/ und Radiotherapie) .................................... 33
1.3.3 Alternative Therapien .......................................................................... 34
1.3.4 Prognose ............................................................................................. 34
1.4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT .................................................................... 38
2. MATERIAL UND METHODEN ..................................................................... 40
2.1 MATERIAL .................................................................................................. 40
2.1.1 Zelllinien ............................................................................................. 40
2.1.2 Transfizierte Zellen .............................................................................. 41
2.1.3 Die Vektoren ........................................................................................ 41
2.1.4 Zytostatika, Lösungen und Reagenzien ................................................. 43
2.1.5 Einmal- Laborbedarf/ Mehrfachartikel ................................................ 46
2.1.6 Geräte ................................................................................................. 47
2.2 DIE ZELLKULTUR ....................................................................................... 49
2.2.1 Zellkultivierung .................................................................................... 49
2.2.2 Collagen-Beschichtung (Coating) ........................................................ 49
2.2.3 Einfrieren/Auftauen ............................................................................. 50
2.2.4 Zellpellets ............................................................................................ 50
2.3 DAS IN-VITRO-ZYTOTOXIZITÄTS-SCREENING (MTT-ASSAY) ..................... 51
2.3.1 Aussiedeln der Zellen ........................................................................... 51
2.3.2 Inkubation mit Zytostatikalösung ......................................................... 51
2.3.3 Standardversuchsablauf des MTT-Assays ............................................ 52
2.3.4 Verdünnungsreihen der Prüfsubstanzen ............................................... 53
2.3.5 Übersicht der Versuchsreihen .............................................................. 54
2.3.6 Auswertung des MTT- Assay ................................................................ 56
2.4 MESSUNG DER TELOMERASEAKTIVITÄT (TRAP- ASSAY) .......................... 57
2.4.1 Proteinisolierung ................................................................................. 57
2.4.2 Proteinbestimmung nach Lowry ........................................................... 58
2.4.3 Durchführung der Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................ 59
2.4.4 Fragmentanalyse ................................................................................. 60
2.4.5 Auswertung des TRAP-Assay ............................................................... 61
2.5 BESTIMMUNG DER TELOMERENLÄNGE (SOUTHERN-BLOT) ........................ 62
2.5.1 DNA-Isolierung ................................................................................... 62
2.5.2 Telomer-Längen-Assay ........................................................................ 63
2.5.3 Auswertung des Southern Blots ............................................................ 68
2.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG...................................................................... 69
3. ERGEBNISSE ................................................................................................... 73
3.1 CHARAKTERISIERUNG DER TRANSFIZIERTEN ZELLEN ................................ 73
3.1.1 Telomerenlänge der Zelllinien (TRF) ................................................... 73
3.1.2 Vergleich der TRF (Passagezahl und transfizierte Zellen) .................... 77
3.1.3 Telomeraseaktivität der Zelllinien ........................................................ 79
3.1.4 Proliferationsverhalten der unbehandelten Kontrollen ......................... 85
3.1.5 Verdopplungsraten der Zellpopulationen (Population Doubling) ......... 90
3.2 ZYTOTOXIZITÄTSTESTUNG ......................................................................... 94
3.2.1 Chemosensitivität transfizierter und nicht-transfizierter Zelllinien ....... 94
3.2.1.1 Inkubation mit Doxorubicin ............................................................. 94
3.2.1.2 Inkubation mit Etoposid ................................................................... 99
3.2.1.3 Inkubation mit Ifosfamid ................................................................ 104
3.2.1.4 Inkubation mit Vincristin ............................................................... 107
3.2.2 Vergleich der Chemosensitivität von STA-ET1 und RM-82 ................. 111
3.2.3 Vergleich der Chemosensitivität nach Transfektion ............................ 112
3.2.3.1 Inkubation mit Doxorubicin ........................................................... 113
3.2.3.2 Inkubation mit Etoposid ................................................................. 115
3.2.3.3 Inkubation mit Ifosfamid ................................................................ 117
3.2.3.4 Inkubation mit Vincristin ............................................................... 119
4. DISKUSSION .................................................................................................. 120
4.1 TELOMERASEAKTIVITÄT BEIM EWING SARKOM ...................................... 120
4.2 TELOMERASE-INHIBITOREN ..................................................................... 121
4.3 GENETISCHE TELOMERASEINHIBITION DURCH DNHTERT ..................... 123
4.4 TELOMERASEINHIBITION UND CHEMOTHERAPIE ..................................... 126
4.5 RISIKEN UND GRENZEN DER TELOMERASEINHIBITION ............................. 129
4.6 LIMITATION DER ANGEWANDTEN METHODIK .......................................... 131
4.7 AUSBLICK ................................................................................................. 132
5. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................. 134
6. LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................ 136
7. DANKSAGUNG .............................................................................................. 154
8. LEBENSLAUF ................................................................................................ 155