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Charakterisierung der Interaktion des KIBRA-Proteins mit der Protein-Kinase M Zeta (PKM Zeta)

Das intrazelluläre Protein KIBRA (KIdney and BRAin) besitzt zwei WW-Domänen, eine C2-Domäne sowie eine Bindungssequenz für die Gruppe der atypischen Protein Kinasen C (aPKC). Über die aPKC-Bindungssequenz interagiert KIBRA mit der neuronenspezifischen, konstitutiv aktiven Protein Kinase M ζ (PKMζ). Weder das genaue Bindungsmotif, noch die physiologische Funktion der KIBRA-PKMζ Interaktion sind bisher bekannt. Zur Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz wurden KIBRA-Deletionsmutanten mit PKMζ ko-präzipitiert. In fluoreszenzmikroskopischen Analysen wurde die Lokalisation und Dynamik von KIBRA und PKMζ in kultivierten Primärneuronen analysiert. Die aPKC-Bindungssequenz in KIBRA konnte auf einen Bereich von 22 Aminosäuren (AS 953-974) eingegrenzt werden. Die Überexpression von KIBRA verzögerte den Proteinabbau von PKMζ. Fluoreszenzmikroskopische Analysen ergaben, dass KIBRA in den Dendriten von kultivierten Primärneuronen transportiert wird und ein Ko-Transport von KIBRA und PKMζ stattfindet.

Titel: Charakterisierung der Interaktion des KIBRA-Proteins mit der Protein-Kinase M Zeta (PKM Zeta)
Weitere Titel Charakterisierung der Interaktion des KIBRA Proteins mit der Protein Kinase M Zeta (PKM Zeta)
Verfasser: Thomas, Christian GND
Gutachter: Pavenstädt, Hermann GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2015
Publikation in MIAMI: 13.02.2015
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: KIBRA; PKC; PKM; Kinase; Interaktion
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-40359659877
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-40359659877
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Inhalt:
Inhalt
1. Einleitung ....................................................................................................... 1
1.1 Eigenschaften des KIBRA Proteins .......................................................................... 1
1.2 Bindungspartner und Funktion des KIBRA Proteins ............................................... 2
1.3 Grundlagen zu PKCζ und PKMζ .............................................................................. 6
1.4 Interaktion von KIBRA mit PKCζ / PKMζ .............................................................. 9
1.5 Zielsetzung dieser Arbeit ........................................................................................ 10
2. Materialien ................................................................................................... 11
2.1 Geräte ..................................................................................................................... 11
2.2 Chemikalien, Lösungen und Puffer ........................................................................ 12
2.2.1 Chemikalien ............................................................................................. 12
2.2.2 Antibiotika ............................................................................................... 13
2.2.3 Lösungen und Puffer................................................................................ 13
2.3 Medien .................................................................................................................... 14
2.3.1 Medien zur Kultivierung von Bakterien (E.coli) ..................................... 14
2.3.2 Medien für eukaryotische Zelllinen ......................................................... 14
2.4 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien ................................................................. 15
2.5 Biologische Materialen .......................................................................................... 16
2.5.1 Antikörper ................................................................................................ 16
2.5.1.1 Primäre Antikörper ............................................................................... 16
2.5.1.2 Sekundäre Antikörper ........................................................................... 16
2.5.2 Enzyme und Marker ................................................................................ 16
2.5.3 Primer ...................................................................................................... 17
2.5.4 Klonierungskonstrukte ............................................................................. 18
2.5.5 Verwendete Organismen ......................................................................... 19
2.6 Sonstige Materialien ............................................................................................... 19
2.7 Software und Internetprogramme ........................................................................... 20
3. Methoden ..................................................................................................... 21
3.1 Anzucht, Kultivierung und Lagerung von Bakterien und eukaryotischen Zellen .. 21
3.1.1 Umgang mit Bakterien (E.coli DH10B) .................................................. 21
3.1.2 Umgang mit eukaryotischen Zelllinen ..................................................... 21
3.2 Arbeiten mit DNA .................................................................................................. 22
3.2.1 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien ..................................... 22
3.2.2 Inokulation von Bakterienkulturen .......................................................... 23
3.2.3 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien ...................................... 23
3.2.4 Restriktionsverdau von DNA .................................................................. 24
3.2.5 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................... 24
3.2.6 Sequenzierung von DNA ......................................................................... 25
3.2.7 Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen ...................................... 26
3.3 Proteinbiochemische Methoden ............................................................................. 27
3.3.1 SDS-Gelelektrophorese ........................................................................... 27
3.3.2 Western Blot Verfahren ........................................................................... 28
3.3.3 Ko-Immunpräzipitation ........................................................................... 29
3.3.4 Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation ........................................... 30
3.3.5 Live Cell Untersuchungen ........................................................................ 32
4. Ergebnisse .................................................................................................... 33
4.1 Bestimmung der aPKC-Bindungssequenz ............................................................. 33
4.1.1 Datenbankanalysen der aPKC-Bindungssequenz .................................... 33
4.1.2 Bindungsfähigkeit von KIBRA-Deletionsmutanten an PKMζ ................ 34
4.1.3 Bindungsfähigkeit der Mutante KIBRA R969W an PKMζ .................... 42
4.2 Bindungsfähigkeit von KIBRA an die Kinase-defiziente Mutante PKMζ K98W . 45
4.3 Stabilisierende Wirkung von KIBRA auf PKMζ ................................................... 47
4.3.1 Auswirkungen der Überexpression von KIBRA auf PKMζ .................... 47
4.3.2 Einfluss von KIBRA auf die Halbwertszeit von PKMζ .......................... 49
4.3.3 Proteasomaler Abbau von PKMζ ............................................................ 51
4.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ........................................................ 53
4.4.1 Nachweis der direkten Interaktion von KIBRA mit PKMζ in vivo ......... 53
4.4.2 Transporteigenschaften von KIBRA in Neuronen .................................. 55
4.4.3 Ko-Transport von KIBRA und PKMζ ..................................................... 60
5. Diskussion .................................................................................................... 62
5.1 Charakterisierung der aPKC-Bindungssequenz ..................................................... 62
5.2 Auswirkungen von KIBRA auf die Stabilität von PKMζ ...................................... 66
5.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ........................................................ 69
6. Zusammenfassung ....................................................................................... 74
7. Ausblick ........................................................................................................ 75
8. Literaturverzeichnis .................................................................................... 76
9. Abbildungsverzeichnis ................................................................................ 84
10. Lebenslauf .................................................................................................... 86
11. Danksagung................................................................................................. 87