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Spezifische Tumortherapie durch Rezeptorvermittelte RNA Interferenz

In der Arbeit mit dem Titel „Spezifische Tumortherapie durch Rezeptorvermittelte RNA Interferenz“ geht es um die Etablierung eines Krebstherapieansatzes für das KRAS-mutierte Kolorektalkarzinom und das Ewing Sarkom. Bei der Therapieform wird siRNA, gerichtet gegen eine bestimmte Mutation der Krebszellen, an einen monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen einen spezifischen Oberflächenrezeptor, gekoppelt und über eine rezeptorvermittelte Internalisierung in die Zielzellen aufgenommen. Dort geht die siRNA in den Weg der RNAi ein und führt in vitro zu einer Reduktion in der Proliferation, die Zellen werden in ein frühes Apoptosestadium gedrängt und es kommt zum Knockdown des Zielgens auf mRNA- und Protein-Ebene. In vivo führt die Behandlung zu einer Reduktion des Tumorwachstums. Normal 0 21 false false false DE X-NONE X-NONE /* Style Definitions */ table.MsoNormalTable {mso-style-name:"Normale Tabelle"; mso-tstyle-rowband-size:0; mso-tstyle-colband-size:0; mso-style-noshow:yes; mso-style-priority:99; mso-style-parent:""; mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt; mso-para-margin-top:0cm; mso-para-margin-right:0cm; mso-para-margin-bottom:8.0pt; mso-para-margin-left:0cm; line-height:107%; mso-pagination:widow-orphan; font-size:11.0pt; font-family:"Calibri",sans-serif; mso-ascii-font-family:Calibri; mso-ascii-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin;}

Titel: Spezifische Tumortherapie durch Rezeptorvermittelte RNA Interferenz
Verfasser: Appel, Neele
Gutachter: Berdel, Wolfgang E. Normdaten
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2017
Publikation in MIAMI: 08.02.2018
Datum der letzten Änderung: 08.02.2018
Schlagwörter: siRNA; RNA Interferenz; monoklonale Antikörper; Ewing Sarkom; Kolorektalkarzinom
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-19169584208
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-19169584208
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Inhalt:
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................. 1
1. Einleitung ...................................................................................................................... 4
1.1 Krebsentstehung und Behandlungsstrategien ...................................................................... 4
1.2 Das Kolorektalkarzinom ...................................................................................................... 7
1.3 Das Ewing Sarkom .............................................................................................................. 9
1.4 Die RNA Interferenz und die Auslöser miRNA und siRNA .................................................... 11
1.5 siRNA-Einsatz in der Krebstherapie .................................................................................... 14
1.5.1 siRNA-Transport über Liposomen ........................................................................................ 15
1.5.2 Nanopartikel ........................................................................................................................ 16
1.5.3 siRNA-Transport über Antikörper-Konjugate ...................................................................... 17
1.6 Verwendete Zielrezeptoren für Antikörper im Rahmen dieser Arbeit ................................. 19
1.6.1 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) ......................................................................... 20
1.6.2 Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (IGF-1R) ................................................................... 22
1.6.3 CD99-Rezeptor ..................................................................................................................... 24
1.7 Eingesetzte monoklonale Antikörper als siRNA-Shuttle ...................................................... 24
1.7.1 Der EGFR Antikörper Cetuximab ......................................................................................... 24
1.7.2 Der IGF-1R Antikörper GR11L .............................................................................................. 25
1.7.3 Der CD99 Antikörper hCD99 ................................................................................................ 25
1.7.4 Der IGF-1R Antikörper A12 V1 ............................................................................................. 25
1.8 Verwendete siRNAs .......................................................................................................... 25
1.9 Ziele der Arbeit ................................................................................................................. 26
1.9.1 Ansatz Kolorektalkarzinom .................................................................................................. 27
1.9.2 Ansatz Ewing Sarkom ........................................................................................................... 28
1.9.3 Kolokalisation von siRNA mit Endosom oder Lysosom ........................................................ 29
2. Material und Methoden .............................................................................................. 30
2.1 Material ........................................................................................................................... 30
2.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterial .......................................................................................... 30
2.1.2 Puffer, Lösungen, Medien ................................................................................................... 35
2.1.3 Chemikalien ......................................................................................................................... 39
2.1.4 Plasmide ............................................................................................................................... 41
2.1.5 Eingesetzte siRNA ................................................................................................................ 41
2.1.6 Primer .................................................................................................................................. 42
2.1.7 Zelllinien ............................................................................................................................... 43
2.1.8 Enzyme ................................................................................................................................. 43
2.1.9 Antikörper ............................................................................................................................ 43
2.1.10 Kits ..................................................................................................................................... 45
2.2 Methoden ........................................................................................................................ 46
2.2.1 Produktion des humanen IGF-1R Antikörpers A12.............................................................. 46
2.2.2 Kopplung von Protamin an Antikörper ................................................................................ 50
2.2.3 Überprüfung der siRNA-Bindemöglichkeit mittels Band-Shift Assay .................................. 52
2.2.4 Überprüfung Rezeptorinternalisierung mittels FACS .......................................................... 54
2.2.5 Coomassiefärbung der Proteingele ..................................................................................... 56
2.2.6 Alexa488-siRNA-Internalisierung ......................................................................................... 57
2.2.7 Behandlungseinfluss von Antikörper-Protamin-siRNA-Komplex auf Koloniebildung der
Zielzellen im Colony Formation Assay .......................................................................................... 58
2.2.8 Überprüfung des Behandlungseinflusses von Antikörper-Protamin-siRNA-Komplex auf den
Stoffwechsel der Zielzellen mit Hilfe des MTS Assays .................................................................. 60
2.2.9 Behandlung der Tumorzellen mit dem Antikörper-siRNA-Komplex für Western Blot,
Annexin V- oder BrdU-Assays ....................................................................................................... 62
2.2.10 Annexin V Assay - Behandlungseinfluss von Antikörper-Protamin-siRNA-Komplex auf die
Apoptose von Zielzellen ................................................................................................................ 63
2.2.11 BrdU Assay - Behandlungseinfluss von Antikörper-Protamin-siRNA-Komplex auf den
Zellzyklus der Zielzellen ................................................................................................................ 63
2.2.12 Nachweis des Proteinknockdowns nach Antikörper-siRNA-Komplex-Behandlung mit Hilfe
eines Western Blots ...................................................................................................................... 64
2.2.13 Nachweis des mRNA-Knockdowns nach Antikörper-siRNA-Komplex-Behandlung mit Hilfe
der Real-Time-PCR ........................................................................................................................ 67
2.2.14 In vivo Xenograft für den Nachweis der Tumorwachstumshemmung nach AntikörpersiRNA-
Komplex-Behandlung ......................................................................................................... 69
2.2.15 Nachweis des Proteinknockdowns nach A12-V1-EWS/FLi1-siRNA-Komplex-Behandlung
im Tumor mit Hilfe eines Western Blots....................................................................................... 70
2.2.16 Klonierung des A12-V1 Produktionsvektors pcDNA3.1(+)/A12-Version-1-G2A-EGFP ...... 71
2.2.17 Immunfluoreszenzfärbungen für die Untersuchung der Kolokalisation von
fluoreszierender siRNA mit frühen Endosomen oder Lysosomen................................................ 75
2.2.18 Zellkultur ............................................................................................................................ 76
3. Ergebnisse................................................................................................................... 78
3.1 Antikörper- und rezeptorvermittelter siRNA-Einsatz im KRAS-mutierten Kolorektal-karzinom
.............................................................................................................................................. 78
3.1.1 EGFR-Antikörper Cetuximab bindet siRNA und initiiert Rezeptorinternalisierung von EGFR
...................................................................................................................................................... 78
3.1.2 EGFR-Antikörper Cetuximab-Protamin transportiert fluoreszierende siRNA in Kolorektalkarzinomzellen
.................................................................................................................... 80
3.1.3 Knockdown von KRAS auf Proteinebene und Wachstumsreduktion von Kolorektalkarzinomzellen
nach in vitro Behandlung mit Cetuximab-Protamin-KRAS-esiRNA ..................... 82
3.1.4 Die Cetuximab-Protamin-KRAS-esiRNA-Behandlung wirkt sich auf die Zell-proliferation
aus, weitere Nachweise durch zusätzliche Viabilitäts-, Proliferations- und Apoptoseassays ...... 85
3.1.5 Wachstumsreduktion von subkutanen Kolorektalkarzinomen in CD1 Nacktmäusen nach
Cetuximab-Protamin-KRAS-esiRNA Behandlung in vivo ............................................................... 88
3.2 Antikörper- und rezeptorvermittelter siRNA-Einsatz in der Ewing Sarkom Therapie ............ 91
3.2.1 Der IGF1-R Antikörper GR11L als Transportmöglichkeit für siRNAs in Ewing Sarkom Zellen
...................................................................................................................................................... 91
3.2.2 Der CD99 Antikörper hCD99 als Transportmöglichkeit für siRNAs in Ewing Sarkom Zellen 99
3.2.3 Der selbstproduzierte IGF-1R Antikörper A12 V1 als Transportmöglichkeit für siRNAs in
Ewing Sarkom Zellen ................................................................................................................... 109
4. Diskussion ................................................................................................................. 124
4.1 Einsatz von siRNA in der Krebstherapie ........................................................................... 124
4.2 siRNA-Therapie beim Kolorektalkarzinom........................................................................ 129
4.3 siRNA-Therapie beim Ewing Sarkom ................................................................................ 133
4.4 Zusammenfassung .......................................................................................................... 137
4.5 Ausblick .......................................................................................................................... 138
5. Summary .................................................................................................................. 140
6. Danksagung .............................................................................................................. 141
7. Literaturverzeichnis................................................................................................... 143
8. Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... 149
9. Tabellenverzeichnis ................................................................................................... 151
10. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ 152
11. Eidesstattliche Erklärung ......................................................................................... 154