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Entwicklung und Evaluierung der „Multilocus Variable Number Tandem Repeat Sequenztypisierung (MLVST)“ zur Typisierung von Enterococcus faecium

Es existieren vielfältige Typisierungsmethoden für Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE), die der Infektionsüberwachung dienen. Die Pulsfeld-Gelelektrophorese hat sich aufgrund des hohen Diskriminationspotentials durchgesetzt, jedoch ist diese Methode von hohem Aufwand geprägt. Die Multilocus-Sequenztypisierung zeichnet sich durch exzellente Datenaustauschbarkeit aus, jedoch fehlt es ihr an Diskriminationsvermögen. Hier wurde die Multilocus Variable Number Tandem Repeat Sequenztypisierung (MLVST), bei der Sequenzdaten eines "Variable Number Tandem Repeat“ mit Sequenzdaten der Haushaltsgene atpA und ddl verknüpft werden, anhand von 38 klinischen VRE-Isolaten evaluiert. Weiterhin konnte die MLVST mittels Multiplex-PCR vereinfacht werden. Der Vergleich von MLVST mit der Typisierungsmethode DiversiLab® zeigte, dass das Diskriminationspotential von MLVST sowie die Konkordanz zu DiversiLab® nicht ausreichen, um MLVST als Typisierungsverfahren in möglichen Ausbruchsszenarien zu etablieren. Normal 0 21 false false false DE X-NONE X-NONE /* Style Definitions */ table.MsoNormalTable {mso-style-name:"Normale Tabelle"; mso-tstyle-rowband-size:0; mso-tstyle-colband-size:0; mso-style-noshow:yes; mso-style-priority:99; mso-style-parent:""; mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt; mso-para-margin-top:0cm; mso-para-margin-right:0cm; mso-para-margin-bottom:8.0pt; mso-para-margin-left:0cm; line-height:107%; mso-pagination:widow-orphan; font-size:11.0pt; font-family:"Calibri",sans-serif; mso-ascii-font-family:Calibri; mso-ascii-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin;}

Titel: Entwicklung und Evaluierung der „Multilocus Variable Number Tandem Repeat Sequenztypisierung (MLVST)“ zur Typisierung von Enterococcus faecium
Verfasser: Constien, Christine GND
Gutachter: Mellmann, Alexander GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2017
Publikation in MIAMI: 19.09.2017
Datum der letzten Änderung: 19.09.2017
Schlagwörter: VRE; E. faecium; Typisierung; Ausbruchsklärung; Multiplex-PCR; VNTR
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-41209643220
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-41209643220
Onlinezugriff:
Inhalt:
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................. 7
1. Einleitung ..................................................................................................................... 9
1.1 Typisierungsmethoden für Vancomycin-resistente Enterokokken......................... 9
1.2 Variable Number Tandem Repeats (VNTR) und Multilocus VNTR Analyse
(MLVA)............................................................................................................ 11
1.3 Multilocus-VNTR-Sequenztypisierung (MLVST)............................................... 11
1.4 Zielsetzung ........................................................................................................... 13
2. Material und Methoden .............................................................................................. 14
2.1 Material ................................................................................................................. 14
2.1.1 Herkunft der verwendeten Vancomycin-resistenten E. faecium-Stämme ......... 14
2.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien .................................................................... 15
2.1.3 Chemikalien ....................................................................................................... 16
2.1.4 Puffer und Lösungen in Eigenherstellung ......................................................... 17
2.1.5 Synthetische Oligonukleotide ............................................................................ 18
2.1.6 Software ............................................................................................................. 18
2.2 Methoden .............................................................................................................. 19
2.2.1 Bakterienanzucht ............................................................................................... 19
2.2.2 DNA-Extraktion mittels InstaGene™ Matrix ................................................... 19
2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion ............................................................................... 19
2.2.4 Multiplex-PCR .................................................................................................. 20
2.2.5 Gelelektrophorese .............................................................................................. 20
2.2.6 Produktaufreinigung mit EXOSAP ................................................................... 21
2.2.7 Sequenzierung ................................................................................................... 21
2.2.8 Rep-PCR ............................................................................................................ 22
2.2.9 Datenanalyse ...................................................................................................... 22
3. Ergebnisse ................................................................................................................... 25
3.1 Typisierbarkeit der verwendeten VREF-Isolate mittels MLVST und rep-PCR... 25
3.2 Vergleich von MLVST und rep-PCR ................................................................... 26
3.3 Korrelation zwischen STMLVST, FP und Resistenztyp .......................................... 29
3.4 Korrelation zwischen STMLVST, FP und Herkunftsstation .................................... 29
3.5 Etablierung einer Multiplex-PCR ......................................................................... 30
4. Diskussion .................................................................................................................. 35
4.1 Diskriminationspotential von MLVST und rep-PCR ........................................... 35
4.2 Konkordanz von MLVST zu rep-PCR und anderen Typisierungsverfahren ....... 36
4.3 Typisierbarkeit und Reproduzierbarkeit mittels MLVST und rep-PCR im
Vergleich zu anderen Typisierungsverfahren ................................................... 39
4.4 Korrelation zwischen MLVST-Profil und Resistenztyp ...................................... 41
4.5 Etablierung einer Multiplex-PCR ......................................................................... 41
4.6 Vorteile und Nachteile der MLVST ..................................................................... 42
4.7 Limitationen der Studie ........................................................................................ 43
4.8 Ausblick: Next Generation Sequencing (NGS) .................................................... 44
5. Zusammenfassung ...................................................................................................... 44
6. Literaturverzeichnis .................................................................................................... 46
7. Abkürzungen .............................................................................................................. 51
8. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ........................................................................ 52
8.1 Abbildungen ......................................................................................................... 52
8.2 Tabellen ................................................................................................................ 52
9. Danksagungen ............................................................................................................ 53
10. Lebenslauf ................................................................................................................ 54