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Expressionsanalyse und funktionelle Charakterisierung von Zyklin A1 und der Interaktionspartner des Zyklin A1-CDK2-Komplexes

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung des hämatopoetischen Systems. Eine Vielzahl von AML-Patienten zeigen im Knochenmark eine hohe Expression des Zellzyklusregulationsproteins Zyklin A1. Hieraus resultierte die Vermutung, dass Zyklin A1 an der Entstehung dieser Erkrankung beteiligt sein könnte. In der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression von Zyklin A1 und seiner Interaktionspartner in AML-Knochenmarkproben analysiert und mit den Expressionswerten in normalem Knochenmark verglichen. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte eine funktionelle Charakterisierung dieser Proteine. Zyklin A1 und alle untersuchten Interaktionspartner des Zyklin A1-CDK2-Komplexes werden im Knochenmark von AML-Patienten in unterschiedlicher Intensität exprimiert. Zudem zeigten einige der Proteine in der funktionellen Analyse einen Einfluss auf Zellproliferation und -differenzierung. Die Daten bilden die Grundlage für weitergehende Untersuchungen eines möglichen Einflusses von Zyklin A1 bzw. seiner Interaktionspartner auf die Entstehung einer AML.

Titel: Expressionsanalyse und funktionelle Charakterisierung von Zyklin A1 und der Interaktionspartner des Zyklin A1-CDK2-Komplexes
Verfasser: Sauer, Tim GND
Gutachter: Müller-Tidow, Carsten GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2009
Publikation in MIAMI: 06.11.2013
Datum der letzten Änderung: 15.06.2016
Schlagwörter: AML; Zyklin A1; Zellzyklus; CDK2; Hämatopoese; Genexpressionsanalyse
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-01589608031
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-01589608031
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Inhalt:
1 Einleitung ............................................................................................................. 1
1.1 Die Hämatopoese ............................................................................................... 1
1.2 Zellzyklusregulation in der Hämatopoese .......................................................... 2
1.3 Die Rolle von Zyklin A1 in der Zellzyklusregulation ........................................ 6
1.4 Die akute myeloische Leukämie (AML) ............................................................ 9
1.4.1 Ätiologie und Pathogenese .......................................................................... 9
1.4.2 Klinische Symptomatik ............................................................................. 10
1.4.3 Diagnostik und Einteilung der AML ......................................................... 11
1.4.4 Aktuelle Behandlungsstrategien und Prognose der AML ......................... 14
1.5 Identifikation neuer Interaktionspartner von Zyklin A1 mittels modifiziertem Hefe-Zwei-Hybrid-System ....................................................... 16
1.6 Ziele und Fragestellung der Arbeit ................................................................... 18
2 Material ............................................................................................................... 20
2.1 Chemikalien und Enzyme ................................................................................ 20
2.2 Laborgeräte ....................................................................................................... 21
2.3 Puffer und Lösungen ........................................................................................ 21
2.4 Nährmedien ...................................................................................................... 22
2.5 Sonstiges ........................................................................................................... 22
3 Methoden ........................................................................................................... 24
3.1 Quantitative real-time RT-PCR (TaqMan)....................................................... 24
3.2 Herstellung der Überexpressions-Plasmide für in vitro-Analysen ................... 29
Inhaltsverzeichnis
3.2.1 Amplifikation der Gensequenzen mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ................................................................................ 29
3.2.2 Plasmide und Primer ................................................................................. 31
3.2.3 Fragmentauftrennung durch Agarosegel-Elektrophorese ......................... 32
3.2.4 DNA-Extraktion aus Agarosegelen ........................................................... 32
3.2.5 Klonierung in den Vektor pcDNA4TM/TO/myc-His ................................. 33
3.2.6 Subklonierung in den retroviralen Vektor pMYs-IG ................................ 34
3.2.7 Subklonierung mit Hilfe des Gateway-Systems ........................................ 35
3.2.7.1 Subklonierung in den pENTRTM-Vektor ........................................... 36
3.2.7.2 Subklonierung in den retroviralen Vektor pMYs-IG mit Hilfe der LR ClonaseTM-Reaktion ............................................... 38
3.3 Transformation kompetenter Escherichia coli-Zellen ..................................... 38
3.3.1 Transformation chemokompetenter Zellen ............................................... 38
3.3.2 Transformation elektrokompetenter Zellen ............................................... 39
3.4 Isolierung und Aufreinigung von Plasmid-DNA ............................................. 39
3.4.1 Plasmid-Präparation aus Bakterien im kleinen Maßstab („Miniprep“) .... 39
3.4.2 Plasmid-Präparation aus Bakterien im großen Maßstab („Maxiprep“) .... 40
3.5 DNA-Sequenzierung ........................................................................................ 40
3.6 RNA-Präparation .............................................................................................. 42
3.7 Synthese von Einzelstrang-DNA (cDNA) aus RNA ........................................ 42
3.8 Methoden zur Analyse von Proteinen .............................................................. 43
3.8.1 Herstellung von Proteinlysaten für Westernblot-Analysen ....................... 43
Inhaltsverzeichnis
3.8.2 Auftrennung der Proteine mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................................................... 44
3.8.3 Westernblot-Analysen ............................................................................... 44
3.9 Zellkultur .......................................................................................................... 45
3.10 Herstellung stabiler Überexpressions-Zelllinien durch retrovirale Transduktion ..................................................................................................... 46
3.10.1 Transfektion der retroviralen Verpackungszelllinie Platinum-E und Herstellung rekombinanter Retroviren ...................................................... 46
3.10.2 Retrovirale Transduktion von 32D-Zellen ................................................ 48
3.10.3 Sortierung transduzierter, GFP-exprimierender 32D-Zellen mittels Durchflusszytometrie (FACS) ................................................................... 48
3.10.4 GFP-Expressions-Kontrolle der stabil transduzierten 32D-Zelllinien mit Hilfe von FACS .................................................................................. 49
3.11 Funktionelle Analysen der stabilen 32D-Überexpressions-Zelllinien ............. 50
3.11.1 Bestimmung des klonalen Wachstums in Methylcellulose („Colony-forming Assay“) ........................................................................ 50
3.11.2 Bestimmung der Proliferationsgeschwindigkeit durch Inkorporation mit 3H-Thymidin ....................................................................................... 51
3.11.3 Zellzyklusanalyse mit Hilfe der Propidiumiodid-Färbung ........................ 52
3.12 Statistische Auswertung der Daten ................................................................... 53
4 Ergebnisse .......................................................................................................... 54
4.1 Ergebnisse der quantitativen real-time RT-PCR-Messungen .......................... 54
4.1.1 Zyklin A1 und ein Großteil seiner Interaktionspartner sind im Vergleich zur GAPDH im Hoden stärker exprimiert als im gesunden Knochenmark ............................................................................................ 54
4.1.2 Im Mittel wird KARCA1 in gesundem Knochenmark stärker exprimiert als in AML-Knochenmark ....................................................... 56
Inhaltsverzeichnis
4.1.3 Die Expression von ARID2 und PROCA1 in AML-Knochenmark ist gegenüber gesundem Knochenmark signifikant gesteigert .................. 57
4.1.4 Zyklin A1 zeigt höchste Expressionswerte in der AML-Unterform M3 ................................................................................. 58
4.1.5 Die KARCA1-Expression ist in der AML-Unterform M6 und in normalem Knochenmark gesteigert, die AML-M3 geht mit einer erhöhten Ubc9-Expression einher ............................................................. 59
4.1.6 FLT3-ITD-Mutationen gehen mit einer signifikant erhöhten Expression von INCA1 und KARCA1 einher .......................................... 60
4.2 Funktionelle Analyse der stabilen 32D-Überexpressions-Zelllinien ............... 62
4.2.1 Klonierung der zu untersuchenden Gene in die Expressionsvektoren ...... 62
4.2.2 Generierung stabiler überexprimierender 32D-Zelllinien und Nachweis der Überexpression ................................................................... 63
4.2.3 Überexpression von GPS2 und INCA1 verringern die Fähigkeit von 32D-Zellen zur Koloniebildung ......................................................... 66
4.2.4 Zyklin A1- und Ku70-überexprimierenden 32D-Zellen zeigen im 3H-Thymidin-Assay signifikante Reduktion der Proliferationsgeschwindigkeit ................................................................... 67
4.2.5 KARCA1-überexprimierende Zellen zeigen 36 Stunden nach Wachstumsstimulation gesteigerte Proliferationsaktivität ........................ 69
5 Diskussion ......................................................................................................... 73
5.1 Zyklin A1 ......................................................................................................... 74
5.2 Ku70 ................................................................................................................. 75
5.3 GPS2 ................................................................................................................. 77
5.4 Ubc9 ................................................................................................................. 79
5.5 ARID2 .............................................................................................................. 82
5.6 RBM4 ............................................................................................................... 84
Inhaltsverzeichnis
5.7 INCA1 .............................................................................................................. 85
5.8 KARCA1 und PROCA1 ................................................................................... 87
5.9 Zusammenfassung und Perspektiven ............................................................... 90
6 Literaturverzeichnis ...................................................................................... 93
7 Danksagung .................................................................................................... 105
8 Lebenslauf ....................................................................................................... 106