Untersuchung zu ubiquitär und nicht ubiquitär exprimierten Antigenen bei Alloantigen-vermittelter T-zellulärer Reaktion nach allogener Stammzelltransplantation
Die allogene Stammzelltransplantation (SZT) ist eine der effektivsten Formen der zellulären Immuntherapie. In der klinischen Forschung zur allogenen Immunzelltherapie, ist u.a. die Charakterisierung von minor Histokompatibilitätsantigenen (mHags) und Tumorantigenen als Zielstruktur der Spender-gegen...
| Verfasser: | |
|---|---|
| Weitere Beteiligte: | |
| FB/Einrichtung: | FB 13: Biologie |
| Dokumenttypen: | Dissertation/Habilitation |
| Medientypen: | Text |
| Erscheinungsdatum: | 2014 |
| Publikation in MIAMI: | 20.02.2015 |
| Datum der letzten Änderung: | 31.07.2020 |
| Angaben zur Ausgabe: | [Electronic ed.] |
| Schlagwörter: | Allogene Stammzelltransplantation; GvHD- und GvT-Reaktionen; minor Histokompatibilitätsantigene (mHag); HY-Antigen; mHAg mismatch Allogeneic transplantation; GvHD and GvT reactions; minor histocompatibility antigens (mHag); HY-Antigen; mHAg mismatch |
| Fachgebiet (DDC): | 570: Biowissenschaften; Biologie
610: Medizin und Gesundheit |
| Lizenz: | InC 1.0 |
| Sprache: | Deutsch |
| Format: | PDF-Dokument |
| URN: | urn:nbn:de:hbz:6-70349373567 |
| Permalink: | https://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hbz:6-70349373567 |
| Onlinezugriff: | diss_robert_stella.pdf |
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| 505 | 0 | |a Zusammenfassung ..................................................................................................... V -- Abstract ................................................................................................................ VI -- 1. Einleitung ................................................................................................... 1 -- Das Immunsystem und das blutbildende System ........................................................ 1 -- Maligne Erkrankungen ................................................................................................ 4 -- Entwicklung einer Immuntoleranz ............................................................................... 5 -- Stammzelltransplantation ............................................................................................ 6 -- Zelluläre Immunreaktionen nach allogener SZT .......................................................... 7 -- i. Host-versus-Graft-Disease (HvGD) ............................................................. 8 -- ii. Graft-versus-Host-Disease (GvHD) ............................................................. 8 -- iii. Graft-versus-Leukemia/Tumor (GvL/GvT).................................................. 12 -- Molekulare Grundlagen des Immunsystems ............................................................. 13 -- i. Major Histocompatibility Complex (MHC)................................................... 13 -- ii. Minor Histocompatibility Antigen (mHag) ................................................... 15 -- iii. Das männliche minor Histokompatibilitätsantigen „HY“ ............................. 15 -- iv. Tumorantigene (engl. Tumor Antibody Generating) ................................... 16 -- Das murine Parent-into-F1-Generation-Transplantationsmodell ............................... 18 -- Ziel der vorliegenden Arbeit ...................................................................................... 20 -- 2. Ergebnisse .............................................................................................. 21 -- 2.1 Etablierung einer Leukämiezelllinie mit einer stabilen HY-Expression .... 22 -- 2.1.1 Retrovirale Transduktion mit Hilfe des Gateway Cloning Systems .. 22 -- 2.1.2 Nachweis des UTY-Gens ................................................................ 29 -- 2.1.3 HY-Expression ................................................................................ 29 -- 2.1.4 In vivo-Passagierung der Tumorzelllinien ........................................ 31 -- 2.2 C1498-GFP-UTY in vivo .......................................................................... 33 -- 2.2.1 Immunogenität des exprimierten Alloantigens HY ........................... 33 -- 2.2.2 Tumorwachstumskinetik in Abhängigkeit der Zellzahl ..................... 33 -- 2.2.3 Tumorwachstumskinetik in Abhängigkeit der Inokulationszeit ......... 34 -- 2.3 Allogene Stammzelltransplantation ......................................................... 37 -- 2.3.1 Konditionierungstherapie ................................................................. 37 -- 2.3.2 GvHD-Entwicklung in Abhängigkeit der Lymphozyten-Zellzahl und des Spenders ................................................................................................ 38 -- 2.3.3 Modulation der GvHD- und der GvT-Reaktion in Abhängigkeit der transferierten Lymphozyten-Zellzahl .............................................................. 40 -- 2.3.4 Chimärismus-Analyse ..................................................................... 41 -- 2.3.5 Das männliche mHag HY ist ein GvHD-Target ............................... 42 -- 2.3.6 Höhere Mortalitätsrate bei einer HY mHags-Disparität .................... 43 -- 2.4 Einfluss des mHags HY auf den GvT-Effekt nach SZT ........................... 44 -- 2.4.1 C1498-GFP-UTY-Wachstumskinetik in Abhängigkeit des HY-Expressionsmusters (in ♀ vs. ♂ CB6F1-Empfängern) .................................. 44 -- 2.4.2 HY wird tumorspezifisch exprimiert (TAA) in ♀ CB6F1-Empfängern 46 -- 2.4.3 HY wird ubiquitär exprimiert in ♂ CB6F1-Empfängern .................... 49 -- 2.4.4 Kontrolltransplantation mit männlichem Transplantat (HY-kompatibel) ........................................................................................................ 51 -- 2.5 Differenzierte Zytokin-Sekretion der allogen transplantierten Gruppen ... 52 -- 2.5.1 IFN-γ-Expression als anti-HY-spezifische T-Zellaktivität ................. 52 -- 2.5.2 Zytokin-Sekretion der allogen transplantierten Empfängertiere ....... 54 -- 2.6 In vitro-Charakterisierung der Effektorzellen ........................................... 57 -- 2.6.1 Identifizierung spezifischer anti-HY-CD8+-T-Zellen ......................... 57 -- 2.6.2 In vivo-Imaging und Infiltration des C1498-GFP-UTY-Tumors ........ 58 -- 2.6.3 Etablierung von T-Zell-Rezeptor(TCR)-Profilen (Spectratyping) ..... 61 -- 3 Diskussion ............................................................................................... 67 -- 4 Fazit und Ausblick ................................................................................... 80 -- 5 Material und Methoden ............................................................................ 82 -- 5.1 Zellkultur .................................................................................................. 82 -- 5.1.1 Kultivierung muriner Tumorzelllinien ............................................... 82 -- 5.1.2 Murine Tumorzelllinien .................................................................... 82 -- 5.1.3 Bestimmung der Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer .............. 83 -- 5.2 Molekularbiologische Methoden .............................................................. 84 -- 5.2.1 RNA-Isolierung ................................................................................ 84 -- 5.2.2 cDNA-Synthese: Reverse Transkription .......................................... 84 -- 5.2.3 DNA-Isolierung ................................................................................ 85 -- 5.2.4 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration ....... 85 -- 5.2.5 Geschlechtsbestimmung mit der Standard-PCR ............................. 85 -- 5.2.6 Nachweis des Ziel-Gens UTY ......................................................... 86 -- 5.2.7 Agarose-Gelelektrophorese ............................................................ 87 -- 5.2.8 Oligonukleotidprimer ....................................................................... 88 -- 5.2.9 Primer für die Standard-PCR .......................................................... 89 -- 5.2.10 Primer für die Sequenzierung .......................................................... 89 -- 5.2.11 Primer für die Real-time-quantitative PCR (qPCR).......................... 89 -- 5.2.12 Primer für die Spectratyping-/Immunoscope-Analyse ..................... 90 -- 5.2.13 Real-time-quantitative PCR (qPCR) ................................................ 91 -- 5.2.14 Stabile Transfektion/Gateway Cloning System ............................... 93 -- 5.3 Proteinbiochemie ..................................................................................... 99 -- 5.3.1 Protein-Isolierung ............................................................................ 99 -- 5.3.2 SDS-PAGE ...................................................................................... 99 -- 5.3.3 Immunoblotting (Western Blotting) ................................................ 100 -- 5.4 In vitro-Generierung von T-Zellklonen gegen das HY-Antigen .............. 101 -- 5.4.1 Bestrahlung der Targetzellen ........................................................ 101 -- 5.4.2 Primäre mixed tumor lymphocyte culture (MTLC) ......................... 102 -- 5.4.3 Sekundäre mixed tumor lymphocyte culture (MTLC) .................... 102 -- 5.4.4 Subklonieren der HY-spezifischen T-Zellen .................................. 102 -- 5.4.5 Screening der positiven T-Zellen ................................................... 103 -- 5.4.6 Kultivierung der positiven T-Zellklone ............................................ 103 -- 5.5 T-Zell-Rezeptor(TCR)-Profil (Spectratyping) ......................................... 103 -- 5.6 Enzyme Linked Immuno Spot Assay (IFN-γ-ELISpot) ........................... 109 -- 5.7 Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS) ..... 110 -- 5.7.1 Antikörper-Färbung ....................................................................... 111 -- 5.7.2 Pentamer-Färbung ........................................................................ 112 -- 5.7.3 Sorten ............................................................................................ 113 -- 5.8 Cytometric Bead Array-Analyse (CBA) .................................................. 113 -- 5.9 Histologie ............................................................................................... 116 -- 5.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) ................................... 116 -- 5.9.2 Immunhistochemische Analyse ..................................................... 117 -- 5.10 Tierexperimentelle Methoden ................................................................ 118 -- 5.10.1 Murines Transplantationsmodell ................................................... 119 -- 5.10.2 Narkotisieren der Mäuse ............................................................... 119 -- 5.10.3 Stammzellgewinnung .................................................................... 120 -- 5.10.4 Isolierung von Splenozyten (Milzzellen) ........................................ 120 -- 5.10.5 Gewinnung von Knochenmarkzellen ............................................. 121 -- 5.10.6 Separation von Zellpopulationen ................................................... 121 -- 5.10.7 Immunisierung der Spendertiere ................................................... 122 -- 5.10.8 Konditionie | |
| 506 | 0 | |a free access | |
| 520 | 3 | |a Die allogene Stammzelltransplantation (SZT) ist eine der effektivsten Formen der zellulären Immuntherapie. <br>In der klinischen Forschung zur allogenen Immunzelltherapie, ist u.a. die Charakterisierung von minor Histokompatibilitätsantigenen (mHags) und Tumorantigenen als Zielstruktur der Spender-gegen-Tumor (Graft-versus-tumor, GvT)-Reaktion und deren Nutzen für den therapeutischen Einsatz nach einer SZT von zentralem Interesse.<br>Ziel der Arbeit war es, am Beispiel des mHags HY, den Einfluss auf die GvHD- und GvT-Reaktion nach einer SZT zu evaluieren. Dabei wurde zwischen einer ubiquitären oder nur selektiven, tumorassoziierten Expression unterschieden. Darüber hinaus sollten die an der GvT-Reaktion beteiligten Effektorzellen charakterisiert werden.<br>Es wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass ubiquitär exprimierte mHags, wie das männliche mHag HY, relevante Zielstrukturen der GvHD sind, jedoch mit einem geringeren Einfluss auf den erwünschten Anti-Tumor-Effekt wirken. | |
| 520 | 3 | |a Allogeneic stem cell transplantation (SCT) is one of the most effective forms of cellular immunotherapy. <br>In clinical research for adoptive immunotherapy of leukemia characterization of minor histocompatibility antigens (mHag) and tumor associated antigens (TAA/TSA) as a target of antitumor response (GvT) and their utility as therapeutic uses after stem cell transplantation (SCT) move more in focus.<br>In this study, we wanted to clarify how far the male mHag HY can affect the GvHD and GvT reactions after SCT, when it is expressed ubiquitously on healthy tissues or selective on tumor only in recipients. In addition, the effector cells involved in the GvT reaction were characterized.<br>Our experimental data indicate that minor Histocompatibility Antigens like the male mHag HY are relevant targets for T cells mediated GvH reaction but less important for the desired GvT effect. | |
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