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miR-142-3p, ein neuer Regulator der Invasivität und Motilität von MDA-MB-468-Mammakarzinomzellen

Diese Dissertation untersucht den Einfluss der miRNA miR-142-3p auf die Pathogenese von Brustkrebs. Die humane Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-468 wurde mit einer Vorstufe von miR-142-3p transfiziert. Die gewonnenen Proben wurden mittels verschiedener Gen- und Proteinexpressionsanalysen sowie funktioneller Assays untersucht. Es zeigte sich eine signifikante Hemmung von Invasivität und Motilität der Zellen bei insignifikant veränderter Proliferationsrate. Das von der miRNA regulierte Zielgen WASL war für die phänotypischen Veränderungen von besonderer Relevanz. Es kodiert für das Protein N-WASP, welches an der Signaltransduktion von Zelloberflächenrezeptoren zum Aktinzytoskelett beteiligt ist. Die negative Regulation des WASL-Gens durch miR-142-3p wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und 3'UTR-Luciferase-Assay bestätigt. Die Daten zeigen eine bislang unbekannte Rolle der mikroRNA miR-142-3p bei der Regulation der Invasivität und Motilität von Mammakarzinomzellen.

Titel: miR-142-3p, ein neuer Regulator der Invasivität und Motilität von MDA-MB-468-Mammakarzinomzellen
Verfasser: Schwickert, Alexander GND
Gutachter: Götte, Martin GND
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2015
Publikation in MIAMI: 21.05.2015
Datum der letzten Änderung: 26.04.2018
Schlagwörter: miRNA; miR-142-3p; Mammakarzinom; N-WASP; Integrin-alphaV; Invasivität; Motilität
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-79259445007
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-79259445007
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Inhalt:
Zusammenfassung……………………………………………………….………….….3
Eidesstattliche Erklärung…………………………………………………………..….4
Inhaltsverzeichnis……………………………………………………………………....7
Abkürzungsverzeichnis…………………………………………………………….....10
Maßeinheiten…………………………………………………………………..............13
1 Einleitung ................................................................................................................... 14
1.1 Aufbau der weiblichen Brust ............................................................................... 14
1.2 Das Mammakarzinom .......................................................................................... 14
1.2.1 Epidemiologie .......................................................................................... 15
1.2.2 Ätiologie .................................................................................................. 15
1.2.3 Lokalisation, Metastasierung und Rezidiv ............................................... 16
1.2.4 Diagnose und Therapie des Primärtumors ............................................... 18
1.2.5 Prognose und Prognosefaktoren .............................................................. 20
1.3 MDA-MB-468-Mammakarzinomzelllinie .......................................................... 21
1.4 Micro-RNA .......................................................................................................... 21
1.4.1 Geschichte der microRNA ....................................................................... 22
1.4.2 Biogenese ................................................................................................. 23
1.4.3 Beteiligung von microRNA an Pathogeneseprozessen............................ 25
1.4.4 MicroRNA miR-142-3p ........................................................................... 27
2 Fragestellung ............................................................................................................. 29
3 Material und Methoden ............................................................................................ 31
3.1 Material ................................................................................................................ 31
3.1.1 Materialien, Geräte und allgemeine Reagenzien ..................................... 31
3.1.2 Zellkultur.................................................................................................. 32
3.1.3 Molekularbiologie, Immunhistochemie ................................................... 33
3.1.4 Antikörper ................................................................................................ 36
3.1.5 Puffer und Lösungen ................................................................................ 37
3.2 Methoden ............................................................................................................. 40
3.2.1 Kultivierung der MDA-MB-468-Brustkrebszellen .................................. 41
3.2.2 Pre-mikro RNA Transfektion .................................................................. 41
3.2.3 Genexpressionsanalyse (1) - Quantitative Mikro Real-Time-PCR ......... 42
3.2.4 Invasionsassay.......................................................................................... 46
3.2.5 Scratch-Assay .......................................................................................... 48
3.2.6 Proliferationsassay (MTT-Stoffwechseltest) ........................................... 48
3.2.7 Zellgrößenbestimmung ............................................................................ 49
3.2.8 Genexpressionsanalyse (2) - Quantitative Real-Time-PCR .................... 50
3.2.9 Western Blots ........................................................................................... 52
3.2.10 3'UTR-Luciferase-Assay ......................................................................... 58
3.2.11 Immunfluoreszenzmikroskopie................................................................ 61
3.2.12 Statistik und Analytik .............................................................................. 63
4 Ergebnisse .................................................................................................................. 64
4.1 Überexpression der miR-142-3p – Quantitative Mikro Real-Time-PCR ............ 64
4.2 Einfluss von miR-142-3p auf die Tumorzellinvasivität ...................................... 65
4.3 Einfluss von miR-142-3p auf die Tumorzellmigration ....................................... 68
4.4 Einfluss von miR-142-3p auf die Tumorzellproliferation ................................... 70
4.5 Einfluss von miR-142-3p auf die Tumorzellgröße .............................................. 71
4.6 Genexpressionsanalysen zur Überprüfung der Regulation von Zielgenen .......... 73
4.7 Expressionsanalyse der potenziell regulierten Zielgene auf Proteinebene .......... 75
4.7.1 N-WASP .................................................................................................. 76
4.7.2 Integrin-α-V ............................................................................................. 77
4.7.3 Cofilin2, RAC1 und NOTCH1 ................................................................ 78
4.8 Bestätigung der Regulation von N-WASP und Integrin-αV durch miR-142-3p . 79
4.9 Immunfluoreszenzmikroskopie ........................................................................... 81
4.9.1 N-WASP .................................................................................................. 81
4.9.2 Integrin-α-V ............................................................................................. 83
4.9.3 Vinculin.................................................................................................... 85
4.9.4 Cofilin2 .................................................................................................... 86
5 Diskussion .................................................................................................................. 88
5.1 miR-142-3p hemmt Invasivität und Motilität von MDA-MB-468-
Mammakarzinomzellen ....................................................................................... 88
5.2 Hauptzielgene und Wirkmechanismen von miR-142-3p..................................... 90
5.2.1 N-WASP ist essentiell für Aktinorganisation an Zonulae adhaerentes und
für die Ausbildung von Invadopodien ..................................................... 90
5.2.2 Integrin-αV ist beteiligt an Migration, Invasion und Zellwachstum ....... 94
5.3 Weitere potenzielle Zielgene von miR-142-3p .................................................... 96
5.3.1 RAC1 und ROCK2 führen zu verminderter Zellgröße und veränderter
Zellmorphologie ....................................................................................... 96
5.3.2 KLF4 und BOD1: potenzielle Regulatoren der Proliferationsfähigkeit ... 98
5.3.3 CFL2 und NOTCH1 – zwei weitere Gene mit Bezug zu Migration und
Invasivität ............................................................................................... 100
5.3.4 Nicht-zytoskelettassoziierte Proteine, die durch miR-142-3p reguliert
werden .................................................................................................... 103
5.4 Kritische Beurteilung des Studienaufbaus ......................................................... 103
5.5 Fazit 106
6 Anhang ..................................................................................................................... 108
7 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 111
Danksagung…………………………………………………………...……..…….....133
Lebenslauf……………………………………………………………………..….….134