Erweiterte Suche

MicroRNA-Analyse von Laser-mikrodissektiertem Gewebe zur Differenzierung zwischen Pankreaskarzinom, Pankreatitis und gesundem Pankreas

Eine Dysregulation von MicroRNAs ist in zahlreichen Malignomen einschließlich des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas nachgewiesen worden. Beim Letzteren ist der Ursprung der Dysregulation jedoch weiterhin unklar. Zur Klärung dieses Sachverhaltes erfolgte in dieser Arbeit ausgehend von Tumor- sowie duktalen Zellen ein Vergleich des MicroRNA-Expressionsmusters zwischen dem Pankreaskarzinom (n=9), der chronischen Pankreatitis (n=7) und dem gesunden Pankreas (n=3). Mittels Laser-Mikrodissektion (LCM) gelang eine Isolation der entsprechenden Zellgruppen aus pankreatischen FFPE-Geweben. Untersucht wurden hierbei die MicroRNAs miR-21*, miR-155, miR-196a sowie die MicroRNA-200-Familie. Verglichen mit dem gesunden Pankreas und der chronischen Pankreatitis konnte eine deutliche Überexpression von miR-196a im Pankreaskarzinom nachgewiesen werden. Die im PDAC vermehrte Expression an miR-196a ermöglichte zudem eine korrekte Identifikation des Selben - ein Umstand, der diagnostisch nutzbar wäre.

Titel: MicroRNA-Analyse von Laser-mikrodissektiertem Gewebe zur Differenzierung zwischen Pankreaskarzinom, Pankreatitis und gesundem Pankreas
Verfasser: Steinfurth, Fabian GND
Gutachter: Mees, Sören Torge GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2014
Publikation in MIAMI: 22.10.2014
Datum der letzten Änderung: 27.07.2015
Schlagwörter: MicroRNAs; Pankreaskarzinom; Laser-Mikrodissektion; LCM; FFPE; Biomarker
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-91369553420
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-91369553420
Onlinezugriff:
Inhalt:
I Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 1
II Verzeichnis der Abbildungen ............................................................................... 11
III Verzeichnis der Tabellen ...................................................................................... 13
1 Einleitung ............................................................................................................... 15
2 Das Pankreaskarzinom ......................................................................................... 21
2.1 Epidemiologie des Pankreaskarzinoms............................................................ 21
2.2 Ätiologie und Pathogenese .............................................................................. 22
2.3 Topographie und Tumorlokalisation............................................................... 28
2.4 Histologische Einteilung des Pankreaskarzinoms .......................................... 28
2.5 Klinische Symptomatik ................................................................................... 29
2.6 Diagnostik ....................................................................................................... 30
2.7 UICC-Klassifikation und Grading .................................................................. 33
2.8 Therapie ........................................................................................................... 35
2.9 Prognose ........................................................................................................... 38
3 MicroRNAs ............................................................................................................ 39
3.1 miRNAs: Definition, Biosynthese, Modifikation und Funktion ...................... 39
3.2 Die Rolle von MicroRNAs in Tumoren .......................................................... 43
3.3 MicroRNA-Deregulation im duktalen Adenokarzinom des Pankreas ............ 47
3.4. Diagnostische Wertigkeit von MicroRNAs beim Pankreaskarzinom ............. 53
3.5. Therapeutische Bedeutung von MicroRNAs beim Pankreaskarzinom ........... 55
3.6. Prognostische Bedeutung von MicroRNAs in Pankreaskarzinomen............... 58
3.7. Anwendung von MicroRNAs in Diagnostik und Therapie ............................. 59
4 Material und Methoden ........................................................................................ 60
4.1 Studiendesign ................................................................................................... 60
4.2 Auswahl der Formalin-fixierten Paraffingewebe (FFPE) ................................ 62
4.2.1 Pankreaskarzinom-Präparate .................................................................... 62
4.2.2 Präparate der chronischen Pankreatitis ..................................................... 64
4.2.3 Präparate des gesunden Pankreas ............................................................. 65
4.3 Anfertigung und Färbung der FFPE-Schnittpräparate ..................................... 66
4.3.1 Erstellung der Schnittpräparate gemäß der „Sandwich“-Schnitttechnik .. 66
4.3.2 Färbung der Schnittpräparate ................................................................... 69
4.4 Histopathologische Reevaluation der Schnittpräparate ................................... 70
4.4.1 Histopathologische Diagnosesicherung .................................................... 70
4.4.2 Festlegung der Dissektionsareale ............................................................. 70
4.5 Die Laser-Mikrodissektion .............................................................................. 72
4.5.1 Prinzip der Laser-Mikrodissektion ........................................................... 72
4.5.2 PALM® MicroBeam ................................................................................ 74
4.5.3 Vorbereitung der Laser-Mikrodissektion ................................................. 76
4.5.4 Durchführung der Laser-Mikrodissektion ................................................ 76
4.6 RNA-Extraktion der Mikrodissektate .............................................................. 79
4.6.1 Durchführung der RNA-Extraktion unter Nutzung des Qiagen miRNeasy FFPE-Kits ................................................................................................................ 79
4.6.2 Photometrische Kontrolle von RNA- Konzentration und -Reinheit ........ 82
4.6.3 Kryokonservierung der Proben ................................................................. 84
4.7 Quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) ................... 84
4.7.1 Prinzip der quantitativen Real-Time-Polymerase-Ketten-Reaktion ......... 84
4.7.2 Auswahl der Primer und des Housekeeping-Gens ................................... 86
4.7.3 Reverse Transkription der RNA in cDNA ............................................... 89
4.7.4 Durchführung der qRT-PCR .................................................................... 90
4.8 Erfassung patientenbezogener Daten ............................................................... 95
4.9 Statistische Methoden ...................................................................................... 96
4.9.1 Hilfsmittel zur statistischen Auswertung .................................................. 96
4.9.2 Untersuchung der klinischen Daten .......................................................... 96
4.9.3 Untersuchung der MicroRNA-Expression in Bezug auf die Pankreasproben ....................................................................................................... 96
4.9.4 Untersuchung von Korrelationen bezüglich der MicroRNA-Expression. 97
4.9.5 Untersuchung der rezidivfreien Zeit ......................................................... 97
4.9.6 Untersuchung der Überlebenszeit ............................................................. 98
5 Ergebnisse .............................................................................................................. 99
5.1 Epidemiologische und klinische Aspekte der Patientengruppen ..................... 99
5.1.1 Klinische und pathologische Charakteristika der PDAC-Patientengruppe 99
5.1.2 Klinische und pathologische Charakteristika der Pankreatitis-Gruppe .. 102
5.1.3 Charakteristika der Kontrollgruppe ........................................................ 103
5.2 Die MicroRNA-Expression ........................................................................... 104
5.2.1 Expression der untersuchten MicroRNAs in Relation zum Haushaltsgen 104
5.2.2 Die Expression der MicroRNAs miR-21*, miR-155 und miR-196a ..... 105
5.2.3 Die Expression der MicroRNA-200-Familie ......................................... 109
5.2.4 Zusammenhänge der MicroRNA-Expression ........................................ 111
5.3 Das diagnostische Potential der untersuchten MicroRNAs ........................... 112
5.3.1 Diagnostisches Potential von miR-21*, miR-155 und miR-196a .......... 112
5.3.2 Diagnostisches Potential der MicroRNA-200-Familie .......................... 115
5.4. Das prognostische Potential der untersuchten MicroRNAs........................... 117
5.4.1 Einfluss der MicroRNA-Expression auf die Rezidivfreiheit .................. 117
5.4.2 Einfluss der MicroRNA-Expression auf die Überlebenszeit .................. 118
6 Diskussion ............................................................................................................ 124
6.1 Diskussion der Methode ................................................................................ 127
6.1.1 Formalinfixierte Paraffingewebe des Pankreas ...................................... 128
6.1.2 Festlegung der Untersuchungsgruppen und Auswahl der Proben .......... 130
6.1.3 Die Laser-Mikrodissektion duktaler Zellen ............................................ 133
6.1.4 Die MicroRNA-Extraktion ..................................................................... 136
6.1.5 Die Reinheitskontrolle bei MicroRNA-haltigen Lösungen .................... 137
6.1.6 Die MicroRNA-Detektion mittels qRT-PCR ......................................... 138
6.1.7 Die Primerauswahl ................................................................................. 140
6.1.8 Das Haushaltsgen RNU6-2 ..................................................................... 146
6.1.9 Kritische Betrachtung der statistischen Auswertung .............................. 148
6.2 Bewertung des Patientenkollektivs ................................................................ 151
6.2.1 Patienten mit duktalem Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ............ 152
6.2.2 Patienten mit chronischer Pankreatitis ................................................... 155
6.2.3 Die Kontrollgruppe der gesunden Pankreata .......................................... 158
6.3 Diskussion der Ergebnisse ............................................................................. 159
6.3.1 Allgemeine Betrachtung der MicroRNA-Expression ............................ 160
6.3.2 Die Rolle von miR-21* im duktalen Adenokarzinom des Pankreas ...... 163
6.3.3 miR-155 im duktalen Adenokarzinom des Pankreas ............................. 170
6.3.4 miR-196a: Ein potentieller Biomarker des Pankreaskarzinoms ............. 178
6.3.5 Die MicroRNA-200-Familie .................................................................. 185
6.3.6 Die azinäre MicroRNA-Expression ....................................................... 198
6.4 Konklusion ..................................................................................................... 200
6.5 Ausblick ......................................................................................................... 207
7 Zusammenfassung ............................................................................................... 210
8 Danksagung ......................................................................................................... 213
9 Curriculum vitae ................................................................................................. 216
10 Quellenverzeichnis .............................................................................................. 218
11 Appendix .............................................................................................................. 237
11.1 Vortrag im Rahmen der 16. Chirurgischen Forschungstage in Regensburg . 237
11.2 Erstellung der Dissertationsschrift ................................................................. 237