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Funktionelle Bedeutung der Interaktion der "Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A" mit dem humanen organischen Kationentransporter 3

Ein Interaktionspartner vom humanen organischen Kationentransporter 3 (hOCT3), einem Transmembranprotein, ist die Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A (DYRK1A), eine Kinase, die beim Down-Syndrom (DS) vermehrt exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde neben der Bestätigung der Interaktion von hOCT3 und DYRK1A auch deren funktionelle Auswirkung auf die Aufnahme des organischen Kations 4-(4-dimethylaminostyryl)-N-methylpyridinium (ASP+) in HEK293-Zellen mittels Mikrofluorimetrie untersucht. Die Überexpression von DYRK1A verursachte eine signifikante Herunterregulation der hOCT3-vermittelten ASP+-Aufnahme, die wiederum durch spezifische Hemmung von DYRK1A aufgehoben werden konnte. Darüber hinaus konnte eine Kolokalisation von DYKR1A und hOCT3 sowohl in HEK293-Zellen als auch in TCam-2-Zellen gezeigt werden. Die Ergebnisse könnten neue Schlüsse auf Pathomechanismen beim Down Syndrom und damit auch auf die Ursache für mentale Retardierung zulassen.

Titel: Funktionelle Bedeutung der Interaktion der "Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A" mit dem humanen organischen Kationentransporter 3
Verfasser: Anaya Cortez, Mario GND
Gutachter: Ciarimboli, Giuliano GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2015
Publikation in MIAMI: 17.07.2015
Datum der letzten Änderung: 17.07.2015
Schlagwörter: DYRK1A; hOCT3; Protein-Protein-Interaktion; Mikrofluorimetrie; Down-Syndrom
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-09209745151
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-09209745151
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Inhalt:
1 EINFÜHRUNG...................................................................................................................... 1
1.1 DIE “MAJOR FACILITATOR SUPERFAMILY” ........................................................................... 1
1.2 DIE „SOLUTE CARRIER“ (SLC) ......................................................................................... 2
1.2.1 Die „solute carrier 22“ (SLC22)-Familie.......................................................................... 2
1.3 DER HUMANE ORGANISCHE KATIONENTRANSPORTER 3 (HOCT3) ..................................... 4
1.3.1 Funktion des hOCT3 ......................................................................................................... 4
1.3.2 Regulation von hOCT3...................................................................................................... 6
1.4 PROTEINKINASEN ........................................................................................................... 7
1.4.1 Die CGMC-Gruppe ............................................................................................................ 8
1.5 DYRK1A....................................................................................................................... 8
1.5.1 Die DYRK-Familie.............................................................................................................. 8
1.5.2 DYRK1A.............................................................................................................................. 9
1.5.3 Funktion von DYRK1A .................................................................................................... 10
1.5.4 Regulation von DYRK1A ................................................................................................ 12
1.5.5 Die Rolle von DYRK1A beim Down-Syndrom ............................................................. 13
1.6 ZIELE DIESER ARBEIT: ................................................................................................... 14
2 MATERIALEN..................................................................................................................... 14
2.1 LÖSUNGEN UND PUFFER............................................................................................... 14
2.2 ZELLLINIEN................................................................................................................... 16
2.3 ZELLMEDIEN................................................................................................................. 16
2.4 BAKTERIEN .................................................................................................................. 17
2.5 BAKTERIENMEDIEN ....................................................................................................... 17
2.6 PLASMIDE .................................................................................................................... 18
2.7 OLIGONUKLEOTIDE ....................................................................................................... 19
2.8 MATERIALEN FÜR DNA-RESTRIKTION UND -LIGATION ..................................................... 20
2.9 MATERIALIEN FÜR PCR UND RT-PCR........................................................................... 21
2.10 MATERIALEN FÜR DIE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ................................................. 22
2.11 ANTIKÖRPER................................................................................................................ 22
2.12 MATERIALEN FÜR CO-IMMUNPRÄZIPITATIONEN ............................................................... 22
2.13 MATERIALIEN FÜR DIE IMMUNFLUORESZENZ-FÄRBUNGEN ............................................... 23
2.14 KITS ............................................................................................................................ 24
2.15 MATERIALIEN FÜR WESTERN BLOTS .............................................................................. 25
2.16 MATERIALIEN FÜR TRANSFEKTIONEN ............................................................................. 26
2.17 SONSTIGE MATERIALEN ................................................................................................ 26
3 METHODEN ....................................................................................................................... 27
3.1 KULTIVIERUNG VON HEK292-ZELLEN............................................................................ 27
3.1.1 HEK293-Zellen ................................................................................................................. 27
3.1.2 Kultivierung der HEK293-Zellen .................................................................................... 27
3.2 KULTIVIERUNG VON TCAM-2-ZELLEN............................................................................. 28
3.2.1 TCam-2-Zellen ................................................................................................................. 28
3.2.2 Kultivierung von TCam-2-Zellen .................................................................................... 28
3.3 TRANSFEKTION VON HEK293-ZELLEN .......................................................................... 28
3.3.1 Transfektion von HEK293-Zellen mit DYRK1A-Plasmid-DNA und hOCT3-GFPTag-
DNA mittels TurbofectTM ........................................................................................................ 28
3.3.2 Transfektion von hOCT3-HEK293-Zellen mit DYRK1A-Plasmid-DNA und hOCT3-
GFP-Tag-DNA mittels LipofectamineTM....................................................................................... 29
3.4 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN VON HEK293-ZELLEN FÜR WESTERN BLOTS............. 29
3.5 BAKTERIEN-METHODEN................................................................................................ 29
3.5.1 Kultivierung und Aufbewahrung von Bakterien............................................................ 29
3.5.2 Herstellung kompetenter Escherichia coli-Bakterien.................................................. 30
3.5.3 Transformation von Plasmid-DNA in E.coli .................................................................. 30
3.5.4 Plasmidpräparationen ..................................................................................................... 31
3.5.5 Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli als Minipräparation........................................ 31
3.5.6 Isolation von Plasmid-DNA aus E.Coli als Maxipräparation ...................................... 32
3.6 DNA-METHODEN ......................................................................................................... 33
3.6.1 PCR.................................................................................................................................... 33
3.6.2 Reverse Transkriptase-PCR........................................................................................... 34
3.6.3 Restriktion von DNA ........................................................................................................ 36
3.6.4 Ligation von DNA............................................................................................................. 36
3.6.5 Aufreinigung von DNA..................................................................................................... 37
3.6.6 Agarosegel-Elektrophorese von DNA........................................................................... 37
3.6.7 DNA-Isolierung aus Agarosegelen ................................................................................ 37
3.6.8 Sequenzierung von DNA ................................................................................................ 38
3.7 KOIMMUNPRÄZIPITATION-EXPERIMENTE......................................................................... 38
3.7.1 Koimmunpräzipitation-Methode ..................................................................................... 38
3.7.2 Koimmunpräzipitation-Protokoll ..................................................................................... 39
3.8 PROTEIN-ANALYSE ....................................................................................................... 40
3.8.1 Sodium Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) .................. 40
3.8.2 Western Blots ................................................................................................................... 41
3.8.3 Ponceau-S-Färbung ........................................................................................................ 41
3.8.4 Immunchemische Detektion von Proteinen nach dem Western Blotting................. 41
3.9 IMMUNFLUORESZENZ-FÄRBUNGEN ................................................................................ 42
3.10 ASP+-MIKROFLUORIMETRIE-MESSUNGEN ..................................................................... 44
3.11 BEHANDLUNG VON HEK293-ZELLEN MIT HARMIN .......................................................... 45
4 ERGEBNISSE .................................................................................................................... 47
4.1 TRANSFEKTION VON HOCT3-HEK293-ZELLEN MIT DYRK1A ........................................ 47
4.2 BESTÄTIGUNG DER INTERAKTION VON HOCT3 UND DYRK1A......................................... 48
4.3 GEMEINSAME EXPRESSION VON DYRK1A UND ROCT3 IN RATTENHIRN.......................... 49
4.3.1 Gemeinsame Expression von DYRK1A und rOCT3 in der Hypophyse................... 50
4.3.2 Gemeinsame Expression von DYRK1A und rOCT3 im Cerebellum........................ 50
4.4 NACHWEIS VON DYRK1A UND HOCT3 MIT RT-PCR IN TCAM2-ZELLEN......................... 51
4.5 NACHWEIS VON HOCT3 IN HOCT3-HEK293-ZELLEN MIT HOCT2-ANTIKÖRPER............. 53
4.6 NACHWEIS VON ENDOGENEM HOCT3 UND DYRK1A IN TCAM2-ZELLEN ......................... 55
4.7 NACHWEIS VON HOCT3-GFP UND DYRK1A IN WILDTYP-HEK293-ZELLEN ................... 58
4.8 HEMMUNG DER ASP+-AUFNAHME VON HOCT3-HEK293-ZELLEN DURCH DYRK1ATRANSFEKTION............................................................................................................
.............. 60
4.9 AUFHEBUNG DES ASP+-AUFNAHME-HEMMENDEN EFFEKTS VON DYRK1A DURCH HARMIN
62
5 DISKUSSION ..................................................................................................................... 64
5.1 INTERAKTION VON DYRK1A UND HOCT3...................................................................... 64
5.2 REGULATION VON HOCT3 DURCH DYRK1A.................................................................. 65
5.3 MÖGLICHE BEDEUTUNG DER INTERAKTION VON HOCT3 UND DYRK1A FÜR DAS DOWN
SYNDROM................................................................................................................................. 66
5.4 AUSBLICK .................................................................................................................... 67
6 LITERATUR........................................................................................................................ 69
7 CURRICULUM VITAE........................................................................................................ 88
8 DANKSAGUNGEN............................................................................................................. 89
9 ANHANG............................................................................................................................... I
9.1 VEKTORKARTEN .............................................................................................................. I