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Untersuchungen zum Einfluss des Epidermal Growth Factor Receptors auf die Reifung bestimmter mikro-RNAs als zelluläre Strahlenantwort

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Epidermal Growth Factor Receptor, ein Mitglied der Rezeptor-Tyrosinkinase Familie und Argonaut2, ein an der RNA-Interferenz beteiligtes Protein, die zelluläre Strahlenantwort auf der Ebene der mikro-RNA Reifung beeinflussen. Mikro-RNAs sind kleine 20-25 Nukleotide lange RNA Moleküle, die Einfluss auf die posttranskriptionale Genregulation nehmen. Es konnte gezeigt werden, dass die mikro-RNAs miR-15a, miR-19a, miR-21, miR-100, miR-106b und miR-218 dem Regulierungssystem aus Epidermal Growth Factor Receptor und Argonaut2 unterliegen. Darüber hinaus konnte die Tumorsuppressorfunktion von miR-218 gezeigt werden, die neben EGFR auch Birc5, Birc6, Decorin, Notch2, Robo1, Tenascin C und Tob1 reguliert und damit Einfluss auf die Invasivität, Motilität, das Zellwachstum sowie das Zellteilungsverhalten nimmt. Die vorliegenden Daten sprechen für eine Feinregulierung der Strahlenantwort von EGFR durch miR-218.

Titel: Untersuchungen zum Einfluss des Epidermal Growth Factor Receptors auf die Reifung bestimmter mikro-RNAs als zelluläre Strahlenantwort
Verfasser: Wischmann, Franz-Josef GND
Gutachter: Greve, Burkhard GND
Organisation: FB 05: Medizinische Fakultät
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2017
Publikation in MIAMI: 05.01.2018
Datum der letzten Änderung: 05.01.2018
Schlagwörter: mikro-RNA; AGO2; EGFR; Bestrahlung; miR-Reifung
Fachgebiete: Medizin und Gesundheit
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-59199471676
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-59199471676
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Inhalt:
1 EINLEITUNG ................................................................................ 1
1.1 Krebserkrankungen in der Bundesrepublik Deutschland ............... 2
1.1.1 Mammakarzinom ............................................................... 2
1.1.2 Lungenkarzinom ................................................................ 6
1.2 Rezeptor-Tyrosinkinasen .......................................................... 8
1.2.1 Physiologie von Rezeptor-Tyrosinkinasen am Beispiel des Epidermal Growth Factor Receptor ............................................... 9
1.2.2 Pathologie von Rezeptor-Tyrosinkinasen am Beispiel des Epidermal Growth Factor Receptor im Mammakarzinom ................ 12
1.3 Mikro-RNAs ........................................................................... 14
1.3.1 Transkription, Spleißen, Nucleus-Export, Reifung und Gene-silencing von mikro-RNAs am Beispiel der miR-218 ....................... 15
1.3.2 Bedeutung von mikro-RNA-Fehlregulationen bei Krebs-Erkrankungen .......................................................................... 19
1.4 Ionisierende Strahlung und ihr Einfluss auf biologische Systeme und biologisch funktionelle Moleküle .................................................... 22
1.5 Zielsetzung der Arbeit ............................................................ 26
2 MATERIAL & METHODEN .............................................................. 28
2.1 Material ................................................................................ 28
2.1.1 Chemikalien ..................................................................... 28
2.1.2 Puffer und Lösungen ......................................................... 30
2.1.3 Zelllinien ......................................................................... 32
2.1.4 Zellkulturmedien und Zusätze ............................................ 35
2.1.5 Enzyme ........................................................................... 36
2.1.6 Primer ............................................................................ 37
2.1.6.1 Housekeeping Gen Assay ............................................. 38
2.1.7 TaqMan® Sonden.............................................................. 39
2.1.8 TaqMan® MicroRNA Assays ................................................ 39
2.1.9 Antikörper ....................................................................... 40
2.1.9.1 Unkonjugierte Primärantikörper .................................... 40
2.1.9.2 Konjugierte Sekundärantikörper ................................... 41
2.1.9.3 Konjugierte Primär-Antikörper ...................................... 42
2.1.10 RNAi Anwendungen ........................................................ 42
2.1.11 Geräte .......................................................................... 42
2.1.12 Verwendete Kits ............................................................. 44
2.1.13 Verbrauchsmaterial ......................................................... 45
2.1.14 Software ....................................................................... 46
2.1.15 Online Datenbanken ....................................................... 46
2.2 Methoden ............................................................................. 47
2.2.1 Zellkultur ........................................................................ 47
2.2.2 Transiente Transfektion ..................................................... 47
2.2.3 RNA Isolation ................................................................... 48
2.2.3.1 total-RNA Isolation ...................................................... 48
2.2.3.2 mikro-RNA Isolation .................................................... 48
2.2.5 cDNA Synthese ................................................................ 48
2.2.5.1 cDNA Synthese von total-RNA Isolaten .......................... 48
2.2.5.2 cDNA Synthese von mikro-RNA Isolaten ........................ 49
2.2.6 PCR und qPCR .................................................................. 50
2.2.6.1 PCR ........................................................................... 50
2.2.6.2 qPCR mit SYTO9 ......................................................... 51
2.2.6.3 qPCR mit TaqMan® Assay ............................................. 53
2.2.7 Bestrahlung von Zellen ..................................................... 54
2.2.8 Vorbehandlung von Zellen mit Cytochalasin D oder Tyrphostin vor Bestrahlung ........................................................................ 55
2.2.9 Western Blot .................................................................... 57
2.2.10 Immunfluoreszenzfärbung und Fluoreszenzmikroskopie ....... 57
2.2.11 Durchflusszytometrie ...................................................... 58
2.2.12 Luc-Pair Duo-Luciferase Assay .......................................... 59
2.2.13 Zell-Invasions-Assay ....................................................... 59
2.2.14 Digitale-Holographische-Mikroskopie ................................. 60
2.2.15 Statistik ........................................................................ 61
3 ERGEBNISSE .............................................................................. 63
3.1 EGFR Expression und miR-218 Reifung in verschiedenen Zelllinien ................................................................................................. 63
3.1.1 EGFR Transkription in verschiedenen Zelllinien ..................... 63
3.1.2 Reifung von miR-218 in verschiedenen Zelllinien .................. 64
3.1.3 Zusammenhang zwischen EGFR Expression und miR-218 Reifung in verschiedenen Zelllinien ............................................. 65
3.2 Zielsequenzen von miR-218 ................................................. 67
3.2.1 Ergebnisse der Target Scan Abfrage für Ziel-mRNAs von miR-218 ......................................................................................... 67
3.2.2 Experimentelle Überprüfung der potentiellen Zielsequenzen von miR-218 .................................................................................. 69
3.2.2.1 Luciferase-Test für EGFR 3´ UTR und miR-218 in MDA-MB-231 Zellen ............................................................................ 69
3.2.2.2 Einfluss der pre-miR-218 Transfektion auf verschiedene mRNAs von MDA-MB-231, BT474 und A549 Zellen ..................... 70
3.2.2.3 Einfluss der pre-miR-218 Transfektion auf die Tanslation verschiedener Proteine von MDA-MB-231, BT474 und A549 Zellen ........................................................................................... 72
3.3 Einfluss von miR-218 auf die Zellphysiologie ............................. 74
3.3.1 Einfluss der pre-miR-218 Transfektion auf die Aktivierung des MAPK Signalweges in MDA-MB-231 Zellen ................................... 74
3.3.2 Einfluss der pre-miR-218 Transfektion auf die Zellmotilität, Zellfläche und Zelltrockenmasse in MDA-MB-231 Zellen ................ 76
3.3.3 Einfluss der pre-miR-218 Transfektion auf die Mitose in MDA-MB-231, BT474 und A549 Zellen ................................................ 80
3.3.4 Einfluss der pre-miR-218 Transfektion auf die Invasivität in MDA-MB-231 Zellen .................................................................. 84
3.4 Einfluss von ionisierender Strahlung auf die Reifung von mikro-RNAs und den daran beteiligten molekularen Bestandteilen .............. 85
3.4.1 Micro-Array Analyse zur Identifikation radiosensitiver miRs ... 85
3.4.1.1 Veränderung der miRs miR-15a, miR-19a, miR-21, miR-100, miR-101, miR-106b und miR-218 4h nach 2Gy Bestrahlung mit und ohne transientem EGFR Knock Down in BT474 Zellen ..... 87
3.4.1.2 Veränderung der miRs miR-15a, miR-19a, miR-21, miR-100, miR-101, miR-106b und miR-218 4h nach 5Gy Bestrahlung mit und ohne transientem EGFR Knock Down in BT474 Zellen ..... 88
3.4.1.3 Veränderung der miRs miR-15a, miR-19a, miR-21, miR-100, miR-101, miR-106b und miR-218 4h nach 2Gy Bestrahlung mit und ohne transientem EGFR Knock Down in A549 Zellen ....... 90
3.4.1.4 Veränderung der miRs miR-15a, miR-19a, miR-21, miR-100, miR-101, miR-106b und miR-218 4h nach 5Gy Bestrahlung mit und ohne transientem EGFR Knock Down in A549 Zellen ....... 91
3.4.2 Einfluss von Tyrosinkinaseinhibition und der Inhibition der Endozytose auf die strahlenabhängige miR-218 Reifung ................ 93
3.4.2.1 Einfluss von Tyrosinkinaseinhibition und der Inhibition der Endozytose auf die strahlenabhängige miR-218 Reifung in BT474 Zellen ................................................................................... 93
3.4.2.2 Einfluss von Tyrosinkinaseinhibition und der Inhibition der Endozytose auf die strahlenabhängige miR-218 Reifung in A549 Zellen ................................................................................... 95
3.4.3 Strahleninduzierte Argonaut2 Phosphorylierung in BT474 und A549 ....................................................................................... 96
3.4.4 Strahleninduzierte EGFR Translokation ................................ 98
3.4.5 Strahleninduzierte Phosphorylierung von EGFR-Tyr-1068 in A549 ..................................................................................... 105
3.4.6 Co-Lokalisation von EGFR und p-AGO2 in A549 und BT474 .. 106
4 DISKUSSION ............................................................................ 111
5 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................... 126
6 DANKSAGUNG .......................................................................... 150
7 LEBENSLAUF ............................................................................. 151
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................... I
TABELLENVERZEICHNIS ................................................................... X
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................ XI