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Einfluss des Primärstoffwechsels auf die Stressantwort und Entwicklung in Nicotiana tabacum

Erhöhungen der pflanzlichen Stresstoleranz sind i.d.R. mit Ertragsverlusten verbunden, da viel Energie für die Stressantworten verwendet werden muss. Ziel der Arbeit war es durch gentechnische Veränderungen des Energie-produzierenden Primärstoffwechsels die generelle Stresstoleranz ohne einen Verlust an Biomasse/Ertrag zu erhöhen. Im Mittelpunkt standen Untersuchungen des oxidativen Pentosephosphatweges, welcher Energie in Form von Reduktionsequivalenten (NADPH) bereitstellt. Ein Isoenzymaustausch des Schlüsselenzyms Glucose-6-Phosphatdehydrogenase (G6PDH) im Cytosol mit einer plastidären Isoform mit verbesserten kinetischen Eigenschaften führte in verschiedenen Tabak-Kultivaren zu einer Erhöhung der generellen Stresstoleranz, ohne gleichzeitigen Ertragsverlust. Konstitutive Veränderungen von zahlreichen Metaboliten (Kohlenhydraten, Prolin, Lipide etc.) und die Zunahme der sogenannten sink-Stärke könnten dabei an der Erhöhung der Stresstoleranz in Blättern und Saatgut beteiligt sein.

Titel: Einfluss des Primärstoffwechsels auf die Stressantwort und Entwicklung in Nicotiana tabacum
Verfasser: Hassa, Sebastian GND
Gutachter: Schaewen, Antje von
Organisation: FB 13: Biologie
Dokumenttyp: Dissertation/Habilitation
Medientyp: Text
Erscheinungsdatum: 2015
Publikation in MIAMI: 28.07.2015
Datum der letzten Änderung: 28.07.2015
Schlagwörter: Glucose-6-Phosphatdehydrogenase (G6PDH); pflanzliche Stressresistenz; oxidativer Pentosephosphatweg (OPP); Isoenzymaustausch; sink-Stärke; Biomasse; NADPH
Fachgebiete: Biowissenschaften; Biologie
Sprache: Deutsch
Format: PDF-Dokument
URN: urn:nbn:de:hbz:6-98289710226
Permalink: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:6-98289710226
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Inhalt:
1 Einleitung ............................................................................................................................. 1
1.1 Bedeutung der pflanzlichen Stressresistenz im Zusammenhang mit globalen Problemen der Menschheit .............................................................................................. 1
1.2 Der oxidative Pentosephosphat-Weg (OPP) – Grundlagen, Regulation und Be-deutung für die pflanzliche Stressresistenz – ................................................................... 3
1.2.1 G6PDH-Isoformen und ihre Regulation ............................................................. 4
1.2.2 Bedeutung der G6PDH für die pflanzliche Stresstoleranz ................................. 6
1.3 Prolin................................................................................................................................ 7
1.4 Pflanzliche Kohlenhydrate – Grundlagen, Regulation und Bedeutung für die pflanzliche Stressresistenz – ............................................................................................ 9
1.4.1 Steuerung der Kohlenhydratverteilung durch Fructose-2,6-bisphosphat und der sink-Stärke ............................................................................................. 14
1.4.2 Zellwand-Invertase als ein Schlüsselenzym des Kohlenhydratstoff-wechsels.............................................................................................................. 18
1.5 Stresstoleranz bei Pflanzen .............................................................................................. 20
1.5.1 Grundlagen der pflanzlichen Pathogenantwort .................................................. 20
1.5.2 Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei der pflanzlichen Stressantwort ...................................................................................................... 22
1.5.3 Kohlenhydrate als Signalmoleküle ..................................................................... 24
1.6 Primärstoffwechsel und pflanzliche Stresstoleranz ......................................................... 25
1.7 Zielsetzung ....................................................................................................................... 27
2 Material und Methoden ...................................................................................................... 29
2.1 Materialien ....................................................................................................................... 29
2.1.1 Enzyme und Chemikalien................................................................................... 29
2.1.2 Kommerzielle Kits ............................................................................................. 30
2.1.3 Bakterienstämme ................................................................................................ 30
2.1.3.1 E. coli .......................................................................................................... 30
2.1.3.2 A. tumefaciens ............................................................................................. 30
2.1.4 Vektoren ............................................................................................................. 31
2.1.5 Oligonukleotide .................................................................................................. 31
2.1.6 Computerprogramme .......................................................................................... 32
2.1.7 Confokale Laser-Scanning-Mikroskopie (cLSM) .............................................. 33
2.2 Methoden ......................................................................................................................... 33
2.2.1 Arbeiten mit Bakterienstämmen ......................................................................... 33
2.2.1.1 Anzucht von Bakterien auf Agarplatten ...................................................... 33
2.2.1.2 Anzucht von Bakterien in Flüssigkulturen .................................................. 34
2.2.1.3 Herstellung von Glyzerinkulturen ............................................................... 34
2.2.1.4 Transformation ............................................................................................ 34
2.2.1.5 Transformation hitzekompetenter E. coli-Zellen ........................................ 35
2.2.1.6 Transformation von A. tumefaciens............................................................. 35
2.2.1.7 Blau-Weiß-Selektion ................................................................................... 35
2.2.1.8 Plasmidisolierung aus E. coli-Zellen ........................................................... 36
2.2.2 Arbeiten mit Nukleinsäuren ............................................................................... 37
2.2.2.1 Gesamt RNA-Extraktion aus Blattmaterial ................................................. 37

2.2.2.2 Herstellung von cDNA aus mRNA mittels reverser Transkription ............. 38
2.2.2.3 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR ..................................... 38
2.2.2.4 Kolonie-PCR ............................................................................................... 39
2.2.2.5 Reinigung von PCR-Produkten ................................................................... 40
2.2.2.6 Restriktionsverdau von DNA-Sequenzen ................................................... 40
2.2.2.7 Dephosphorylierung von DNA-Enden ........................................................ 40
2.2.2.8 DNA-Ligation ............................................................................................. 41
2.2.2.9 Sequenzierung von DNA ............................................................................ 41
2.2.2.10 Ortsgerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis, SDM) ................... 41
2.2.2.11 Bestimmung der Nukleinsäurenkonzentration ............................................ 42
2.2.2.12 Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................... 43
2.2.2.13 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen .................................. 43
2.2.3 Arbeiten mit Pflanzen ......................................................................................... 44
2.2.3.1 Verwendete Organismen und ihre Anzucht ................................................ 44
2.2.3.2 Die Tabakpflanze Nicotiana tabacum ......................................................... 44
2.2.3.3 Das Pathogen Phytophthora nicotianae (van Breda de Haan) .................... 44
2.2.3.4 Infiltration von source-Blättern ................................................................... 45
2.2.3.6 Stabile Transformation von Tabakpflanzen ................................................ 45
2.2.3.7 Bestimmung des Kohlenhydratgehaltes der source-Blätter ........................ 47
2.2.3.8 Bestimmung der Aktivität von Zellwand-Invertase in source-Blättern ........................................................................................................ 48
2.2.3.10 Erstellung eines metabolischen Profils anhand von MALDI-TOF ............. 49
2.2.3.11 Bestimmung der Hormonkonzentration ...................................................... 50
2.2.3.12 Bestimmung der Biomasse .......................................................................... 50
2.2.3.14 Mikroskopischer Nachweis von Zelltod...................................................... 51
2.2.3.15 Mikroskopischer Nachweis von Kallose ..................................................... 51
2.2.3.16 Mikroskopischer Nachweis von ROS ......................................................... 51
2.2.3.17 Salzstressanalyse von source-Blättern ........................................................ 52
2.2.3.18 Saccharoseexport aus source-Blättern......................................................... 52
2.2.4 Arbeiten mit Proteinen ....................................................................................... 52
2.2.4.1 Proteinextraktion aus Tabakblättern ............................................................ 52
2.2.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford .............................................................. 53
2.2.4.3 Proteinauftrennung durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese............. 53
2.2.5 Analyse von Tabaksamen ................................................................................... 56
2.2.5.4 Proteingehaltbestimmung von Saatgut ........................................................ 56
2.2.5.5 Kohlenhydratgehaltbestimmung von Saatgut ............................................. 57
2.2.6 Bestimmung von Fructose-2,6-bisphosphat ....................................................... 58
3 Ergebnisse ............................................................................................................................ 60
3.1 Charakterisierung der Tabaksorte Xanthi nach Isoenzymaustausch der G6PDH im Cytosol ............................................................................................................................. 60
3.1.1 Charakterisierung der biotischen Stressantwort der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol .................................................... 61
3.1.1.1 Pathogen-induzierte Zelltodrate .................................................................. 62
3.1.1.2 Abwehr-induzierte Bildung von Kallose ..................................................... 64
3.1.1.3 Abwehr-induzierte Bildung von ROS ......................................................... 65
3.1.2 Charakterisierung der abiotischen Stressantwort der Tabaksorte Xanthi ........... 68
3.1.2.1 Steigerung der NaCl-Toleranz in source-Blättern nach Isoenzym-austausch der G6PDH ................................................................................. 68
3.1.2.2 Steigerung der Keimungsrate bei NaCl- und Trockenstress ....................... 69

3.1.3 Charakterisierung des Primärstoffwechsels der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ............................................................ 71
3.1.3.1 Anreicherung von Kohlenhydraten in source-Blättern der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ........................................ 71
3.1.3.2 Reduktion des Saccharoseexportes in source-Blättern der Tabak-sorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ........................ 72
3.1.3.3 Erhöhung der sink-Aktivität in source-Blättern der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ................................. 73
3.1.3.4 Erhöhung der Fructose-2,6-bisphosphat-Gehalte in source-Blättern der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ........................................................................................................ 74
3.1.3.5 Veränderungen von Photosyntheseparametern in source-Blättern der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ........................................................................................................ 74
3.1.3.6 Veränderungen von Hormongehalten in source-Blättern der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol .............. 76
3.1.3.7 Anstieg der Prolingehalte in source-Blättern der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ............................................ 77
3.1.3.8 Veränderungen der Biomasse, Samenkomposition und Samen-qualität der Tabaksorte Xanthi nach Isoenzymaustausch der G6PDH im Cytosol ..................................................................................... 78
3.1.3.9 Steigerung der Biomasseproduktion der Tabaksorte Xanthi nach Isoenzymaustausch der G6PDH im Cytosol ............................................... 78
3.1.3.10 Saatgutqualität der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzym-austausch im Cytosol ................................................................................... 80
3.1.3.11 Samenkomposition ...................................................................................... 80
3.1.3.12 Veränderung des Grundmetabolismus bei der Tabaksorte Xanthi nach G6PDH-Isoenzymaustausch im Cytosol ............................................ 81
3.2 Erstellung der Doppeltransformanten .............................................................................. 84
3.2.1 Erstellung eines neuen RNAi-Konstruktes zur selektiven Reprimierung der cytosolischen G6PDH .................................................................................. 85
3.2.2 Das neue Doppelkonstrukt pZM8 ...................................................................... 86
3.2.2.1 Transformation des neuen Doppelkonstruktes pZM8 ................................. 87
3.2.2.2 Charakterisierung der Doppeltransformanten X::cP2 ................................. 89
3.2.2.3 Interaktion zwischen P. nicotianae und den Doppeltransformanten X::cP2 .......................................................................................................... 90
3.2.3 Einfluss der zuckerhaltigen Anzucht auf den Kohlenhydratstatus bei SNN .................................................................................................................... 92
3.3 Charakterisierung der cwINV::cP2-Doppeltransformanten............................................. 95
3.3.1 Messung der cwINV-Aktivität ........................................................................... 96
3.3.2 Abwehrreaktion der cwINV-Doppeltransformanten .......................................... 96
3.3.3 Anreicherung von Kohlenhydraten in den cwINV-Doppeltrans-formanten............................................................................................................ 97
3.4 Charakterisierung der SNN::cP2-Doppeltransformanten ................................................ 99
4 Diskussion .......................................................................................................................... 101
4.1 Veränderungen im Grundstoffwechsel von Tabakblättern und Samen nach Isoenzymaustausch der G6PDH im Cytosol .................................................................. 101
4.2 Erhöhung der Stresstoleranz in Tabak nach Isoenzymaustausch der G6PDH im Cytosol ...................................................................................................................... 104

4.3 Erhöhung von Biomasse und Ertrag nach Isoenzymaustausch der G6PDH im Cytosol ........................................................................................................................... 114
5 Zusammenfassung und Ausblick ..................................................................................... 115
6 Literatur ............................................................................................................................ 118
7 Anhang ............................................................................................................................... 142
7.1 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 142
7.2 Abbildungsverzeichnis................................................................................................... 145
7.3 Tabellenverzeichnis ....................................................................................................... 147
7.4 Vektor ............................................................................................................................ 148
7.4.1 pZM8 ................................................................................................................ 148
7.5 Sequenzierung ................................................................................................................ 148
7.5.1 pZM8 ................................................................................................................ 148
Lebenslauf
Danksagung